知识主线 思维串联 微专题1 基因工程 1.基因工程的3种基本工具 2.基因工程的操作流程 1获取目的基因的3种途径 提醒①从cDNA文库获取的目的基因不含启动子和终止子。
②利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连接到一起。
2基因表达载体的构建重组质粒的构建 提醒①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
②启动子、终止子 a.启动子DNA片段≠起始密码子位于mRNA上。
b.终止子DNA片段≠终止密码子位于mRNA上。
③目的基因插入位置启动子与终止子之间。
3将目的基因导入受体细胞 4目的基因的检测与鉴定 3.转基因生物的三大安全性问题 1食物安全滞后效应、过敏原、营养成分改变等。
2生物安全对生物多样性的影响等。
3环境安全对生态系统稳定性的影响等。
4.蛋白质工程 题型一 工具酶的应用 1.下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是 A.HindⅢ B.EcoRⅠ C.EcoB D.PstⅠ 解析 A处有3处BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，结合题中选项可知，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处。
答案 C 2.嗜热土壤芽胞杆菌产生的β－葡萄糖苷酶BglB是一种耐热纤维素酶。为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验。如图为质粒限制酶酶切图谱，下表为几种限制酶的识别序列及酶切位点。请回答下列问题 限制酶 BamH Ⅰ Hind Ⅲ EcoR Ⅰ Nde Ⅰ 识别序列及切割位点 G↓GATCC A↓AGCTT G↓AATTC C↓ATATG 1通常情况下，获得的目的基因需要进行扩增，最简便的方法是________技术。
2分析上图，可选择________和________两种不同的限制酶切割质粒，以防止质粒自身环化。质粒被切割后，可用________将其与目的基因连接。在动物基因工程中将目的基因导入受体细胞时通常的方法是________。
3大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为____________________________________________________ _____________________________________________________________________。
4蛋白质工程是第二代基因工程，它的基本途径是从预期的蛋白质功能出发→________________________→________________________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
答案 1PCR 2Nde Ⅰ BamH Ⅰ DNA连接酶 显微注射法 3转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶 4设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 题型二 基因工程的应用及蛋白质工程 3.2019无锡一模下列关于基因工程的叙述，正确的是 A.构建表达载体时需要在目的基因前加上起始密码子 B.农杆菌转化法可以将目的基因随机插入受体细胞的染色体DNA上 C.标记基因中不能有限制酶的识别位点以防止其被破坏而失去作用 D.导入人胰岛素基因的大肠杆菌可直接生产出有活性的人胰岛素 解析 构建基因表达载体时需要在目的基因前加上启动子；
农杆菌的Ti质粒的T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，依据农杆菌的这一特点，采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上，可以将目的基因随机插入受体细胞的染色体DNA上；
标记基因中可以有限制酶的识别位点，为了防止标记基因被破坏而失去作用，在构建基因表达载体时，使用的限制酶应该不具有识别标记基因中的限制酶的识别位点的能力；
导入人胰岛素基因的大肠杆菌，因没有内质网和高尔基体，不能对胰岛素进行加工，所以不能直接生产出有活性的人胰岛素。
答案 B 4.2019天津卷，9B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞2n和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答 1B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________单选。
A.含B基因的染色体缺失 B.DNA聚合酶失活 C.B基因发生基因突变 D.B基因的启动子无法启动转录 2从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光连接成融合基因表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能，然后构建重组表达载体。
3在过程①、②转化筛选时，过程________中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程________在培养基中应加入卡那霉素。
4获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________多选。
A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交 B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交 C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交 D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光 5从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明____________________________________________________。
解析 1启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录，推测最可能的原因是卵细胞中B基因的启动子无法启动转录，D符合题意。2B基因在体细胞和精子中正常表达，说明在水稻的体细胞和精子中有B基因转录而来的mRNA。从水稻体细胞或精子中提取总RNA，反转录产生多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做水稻的cDNA文库。3过程①是指含有目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌，过程②是指将含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。为了检测含有目的基因的重组Ti质粒是否转入农杆菌，过程①需在培养基中加入卡那霉素。4DNA分子杂交是将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，将探针与基因组DNA杂交，看是否出现杂交带。将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交，不能用于筛选含目的基因的转基因植株，A错误；
B－Luc融合基因中含有水稻B基因编码蛋白的序列和Luc基因，因此，以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交可达到实验目的，B正确；
转基因植株卵细胞中的B基因能够转录出mRNA，因此以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交可达到实验目的，C正确；
Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，可以达到实验目的，D正确。5一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，而在转基因植株中能发现由未受精的卵细胞发育形成的胚，说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
答案 1D 2精子 cDNA 3② ① 4BCD 5B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚 微专题2 PCR技术及DNA的粗提取与鉴定 1.PCR相关技术原理与条件 2.PCR的反应过程及结果 3.DNA的粗提取与鉴定 1.2019常州一模利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的有 A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连 C.退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16 解析 PCR是一项在生物体外复制特定的DNA分子片段的技术，其前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，不需要知道其全部序列就可扩增；
PCR过程中需要两种引物分子，不同引物能靠碱基互补配对而形成部分双链的话会造成引物不能同模板DNA结合，也就不能发生进一步的链式反应，这一点需要避免；
若退火温度过高，则引物与模板DNA无法形成部分双链，PCR也就不能发生；
由图可知，由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮循环共产生16个DNA分子，其中2分子DNA只含有1种引物，因此同时含有A和B引物的DNA分子是14个，占14/16。
答案 D 2.2019全国卷Ⅰ，38基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
1基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
2生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
3目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________________________________________________________ ____________________________________________________________________。
解析 1基因文库包括基因组文库和cDNA文库。2生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。3在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
答案 1基因组文库 cDNA文库 2解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 3Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 微专题3 细胞工程 1.把握细胞工程六大技术原理 2.植物组织培养过程 1植物组织培养的2个关键 提醒①固体培养基组成无机营养、有机营养、激素、琼脂。
②植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
2针对三类目标试管苗、人工种子、细胞产物的培养流程 3.植物体细胞杂交技术 1细胞壁酶解方法用纤维素酶和果胶酶处理。
2促融方法①物理法离心、振动、电激等；
②化学法聚乙二醇PEG。
3概念植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞，在一定