抗,体,制,药

3 1960年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白 由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质 因此制 的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物 故称为多克隆抗体 易出现非特异性交叉反应 4 1975年K hler and Milstein等首次利用B淋巴细胞 杂交瘤技术制备出 McAb 在临床上主要用于诊断和治疗 McAb由一个B细胞克隆产生的 只能识别某一个抗原表位的高 度特异性抗体 McAb 在免疫导向疗法中存在的困难 障碍 A McAb均是鼠源性抗体 应用于人体内可产生人抗鼠抗体 HAMA 加速了排斥反应 在人体内的半衰期只有5 6h 难以维 持有效药物作用靶组织时间 B 完整的抗体分子的相对分子质量过大 难以穿透实体肿瘤组 织 达不到有效的治疗浓度 解决问题的方法或途径 基因工程技术 A 降低McAb的免疫源性 B 降低McAb的相对分子质量 5 1984年报道了人 鼠嵌合抗体 之后制备出了 改型抗体 单链抗体 单域抗体 最小识别单位等 多种类型 基本上消除了抗体的鼠源性 免疫源性 相对分子质量只有完整抗体分子的1 80 1 3 6 1994年Winter创建了噬菌体抗体库 技术 以基 因工程方法制备抗体并发展成抗体工程 它是抗体 研究领域的一次技术革命 它不用人工免疫动物和 细胞融合技术 完全用基因工程技术制备人源性抗 体 第二节 单克隆抗体及其改造 Monoclonal Antibody 一 制备单克隆抗体的一般流程 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞 融合 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单 克隆细胞系而产生的 由于这种抗体是针对一个抗原决定簇 的抗体 又是单一的B淋巴细胞克隆产生的 故称为单克隆 抗体 1 抗原与动物免疫 免疫方法 体内免疫和体外免疫 抗原 颗粒性抗原和可溶性抗原 免疫动物 BALB c小鼠和Lou大鼠 2 细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 基本方法 取适量脾细胞 1 108 与骨髓瘤细胞 2 107 3 107 进行混合 在PEG作用下诱导它们融合 时间控 制在2min以内 然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件 1 融和率高 2 自身不分泌抗体 3 所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定 PEG的相对分子质量和浓度越大 其促融和率越高 但 其黏度和对细胞的毒性也随之增大 常用浓度为40 50 相对分子质量4000为佳 相对分子质量在400 6000 浓 度在10 60 范围内的PEG都能使细胞发生融合 为了提高融合率 在PEG 溶液中加入DMSO 二甲基亚 砜 以提高细胞接触的紧密性 增加融合率 但必须严 格限制接触时间 1 细胞融合液中的细胞类型 4或5种 2 如何去除脾 瘤融和细胞以外的细胞 常用选择性 培养基 细胞融合后 可产生多种融合细胞 如脾 脾 脾 瘤 瘤 瘤的融合细胞 而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞 这些细 胞比脾 瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快 并能将其淘汰 为此 可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行 培养 常用的选择培养基为HAT培养基 它是用次黄嘌吟 H 氨 基喋吟 A 和胸腺嘧啶配制的 其中氨基喋吟 A 能阻断DNA合成 的主要途径 瘤 瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡 脾 脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下 几天内亦迅 速死亡 由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶 HGPRT 缺乏株 脾细胞内却有这种酶 因此脾 瘤融合的杂交 瘤细胞可利用HGPRT酶 用次黄嘌吟 H 和胸腺嘧啶合成DNA 使 杂交瘤细胞得以生长 在最适的培养条件下 大约有105个脾细胞才能形 成一个杂交瘤细胞 大量瘤细胞在HAT培养液中相继死 亡 单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活 在体外的细胞培养中 单个的或数量很少的细胞不 易生存与繁殖 必须加入其它活的细胞才能使其生长 繁殖 加入的细胞称之为饲养细胞 所以通常要加入 饲养细胞才能使其繁殖 常用的饲养细胞有小鼠腹腔 巨噬细胞 脾细胞和胸腺细胞等 一般认为饲养细胞 能释放某些生长刺激因子 并能满足杂交瘤细胞对细 胞密度的依赖性 小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细 胞 故应用的较多 3 筛选阳性克隆与克隆化 常用的检测方法 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫技术 常用的克隆化方法 有限稀释法和软琼脂法 有限稀释法 把杂交瘤细胞悬液稀释后 加入到 96孔板 使每孔中在理论上只含有一个细胞 第一次 克隆化时也要应用HT培养液 以后的克隆化可用不含 HT的RPMI 1640培养液 软琼脂法 在培养液中加入0 5 的琼脂糖凝胶 细胞分裂后形成小球样团块 由于培养基是半固体状 态 可用吸管吸出 移入96孔板培养 筛选阳性克隆与克隆化 因为抗体产生细胞只占所有脾细胞的5 左右 所以要进行每孔培养上清 的抗体活性的筛选工作 以选择出阳性克隆 然后进行克隆化培养 并 检测大批标本 免疫酶技术因不需进行放射性核素操作 方法简便 又适于检测大批标本等 优点而被广泛采用 通过引入生物素 亲和素等放大系统可进一步提高 灵敏性 一般说来免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗 粒性抗原的抗体检测 免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测 特别是制备以检测患者活检组织 标本为目的的抗体时 免疫荧光法则更有意义 在筛选抗体的同时 还 能对所识别的抗原进行定位判定 下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤 风毒素抗体为例进行说明 4 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数 40 全部为端着丝粒 小鼠骨髓瘤细胞染色体 SP2 0细胞为62 68 NS 1为 54 64 有中部和亚中部着丝点 杂交瘤细胞的染色体数目 接近两亲本细胞染色体数目 的总和 在结构上多数为端着丝粒染色体外 还应出现少数 标志染色体 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体 反之 则反 5 单克隆抗体的大量制备 1 体外培养法 用于抗原免疫性极弱 获得的抗体较少 多采用RPMI 1640培养液 添加10 20 胎 牛或小牛血清 但由于培养液中含有血清成分 总蛋白量可达100 g ml以上 给纯化带来困难 加入小牛血清又是发生支原体污 染的原因 而且批间质量差异太大 直接影响杂交瘤细胞的生长 改良的方法有 无血清培养法 悬浮培养法 微载体悬浮培 养法 无血清培养法 利用白蛋白 胰岛素 转铁蛋白 乙醇胺等 混合物代替小牛血清 此法虽可减少污染 但产量不高 悬浮培养法 连续悬浮培养的细胞密度可达2 107 ml 收集 的单克隆抗体可达400 g ml 如在培养液中加入微载体 细胞 密度可达108 ml 2 动物体内诱生法 用于抗原免疫性较强 常用 基本程序 接种前1 2周 小鼠腹腔注射0 5ml Pristane 降 植烷 或用液体石蜡 然后注射1 106杂交瘤细胞 7 12d便有腹 水生成 待生成腹水后再提取 离心去细胞沉淀 取上清液冻存 优点 操作简便 比较经济 所得单克隆抗体量多且效价高 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞 株 缺点 小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白 给纯化带来 难度 6 单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不 同的纯化方法 体外诊断试剂IgG类 沉淀处理 亲和层析 IgM类 沉淀处理 凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药 亲和 层析 阴离子交换层析 并注意除去毒素 病毒 核酸等微量的污染物 动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序 1 澄清和沉淀处理 a 1000g 离心5min 去除沉淀物 红细胞 细胞碎块 纤维 蛋白凝块和脂质 b 20 000g 高速离心30min 去除残留的小颗粒物质 c 用0 2 m微孔滤膜过滤 去除细菌 支原体 d 饱和硫酸铵沉淀抗体 50 饱和硫酸铵能回收90 以上的 抗体 2 分离 A 凝胶过滤 用于IgG和IgM类 常用SephadexG 200 作为分离介 质 可收集到3个峰 最高峰为IgM 另外两个峰为 IgG 抗体回收率 达50 80 能去除污染的微量杂蛋白 抗体纯度可达95 以上 B 阴离子交换层析 用于IgG类的分离纯化 在pH7 4条件下 IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上 其中IgG2a可在较低离子强度下洗脱 下来 其纯度很高 IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀 可增 加离子强度以提高产量 但其纯度相对较低 C 亲和层析 多用蛋白A亲和层析 适用于IgG类 IgG类与蛋白A 的结合与pH 有密切的关系 鼠源性单抗在 pH8 0时 IgG2b IgG3几 乎全部结合在蛋白 A柱上 IgG1稍差 用 pH3 5缓冲液可洗脱下 IgG2b pH4 0缓冲液可洗脱下 IgG3 pH4 5缓冲液可洗脱下IgG2a pH6 0可洗脱下IgG1 用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度和很高 但也 有极微量的杂蛋白 二 鼠源性单克隆抗体的改造 目的 一是降低免疫源性 二是降低相对分子量 增加组织通透性 原理 抗体同抗原结合的功能决定于 抗体分子的可变区 V 生物功能则决 定于抗体分子的稳定区 C 鼠源性单克隆抗体的改造 1 人 鼠嵌合抗体 chimeric antibody 把鼠源性单克隆抗体的V 区基因分离出来 分别与人Ig的C区基因连接 即成为人 鼠嵌合抗体的基因 再共转染骨髓瘤细胞 就能表达出完整的Chimeric Antibody 2 改型抗体 Reshaping antibody 用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替 换人 Ig分子中的CDR序列 则可使人的 Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原 结合特异性 抗体分子中鼠源部分只占很小比例 可基本消除免疫源性 这 种改型抗体也称CDR移植抗体 CDR grafting antibody 3 小分子抗体 小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段 其相 对分子质量仅为原抗体的1 80 1 3 1 Fab片段抗体 VH CH1 3 单链抗体 VH Linker VL 2 FV抗体 VH VL 4 单域抗体 VH或VL 5 最小识别单位 MRU 单个CDR区构成 4 双功能抗体 双特异性抗体 bispecificantibody BsAb 是一种非天然性抗体 其结合抗原的两个臂具有不同的特异 性 5 抗体融合蛋白 从广义讲应属于双功能抗体范畴 是 20世纪90年代发展的研究领域 类型如下 1 配基 配基型融合蛋白 如 CD4 Fc 2 配基 Ig型嵌合抗体 如 IL 2 Ig 3 配基 FV型嵌合蛋白 如 CD4 FVCD3 4 受体 FV型融合蛋白 5 酶 抗体型融合蛋白 abeneyme 抗体酶 第三节 抗体工程 抗体研究的三个阶段 以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表 其 特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体 以1975年K hler创建杂交瘤技术制备单克隆抗 体为代表 以1994年Winter完全用基因工程技术制备人源 性抗体 而且还能通过细菌发酵或转基因动物 或转基因植物大规模生产抗体 在此基础上发 展成抗体工程 他创建了噬菌体抗体库技术 克服了人体不能随意免疫的缺点 用人外周血 制备抗体文库 从而获得人源性基因工程抗体 一 噬菌体抗体库技术的基本方法 1 获取目的基因 2 抗体库技术的载体 3 淘筛 panning 4 表达与鉴定 1 获取目的基因 提取RNA经反转录PCR RT PCR 获取抗 体某一特定基因区段 如重链和轻链可 变区 VH VL 基因 抗体基因的组合形式 多为单链抗体SCFV 也用连接链 G4S 3组 合成功能分子 2 抗体库技术的载体 现在普遍使用噬菌粒载体 它具有噬 菌体和质粒的共同特点 因为它的转化 效率高有利于提高文库容量 抗体蛋白 和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表 达在载体表面 再感染后 能使目的克 隆得以扩增 琥珀终止码在适当位置上 引人载体是抗体库的关键性技术 而克 隆位点后的基因序列则有利于对可溶性 表达产物的鉴定和纯化 3 淘筛 基本过程是 抗原固相化后 对噬菌粒群 的吸附 洗涤和洗脱后再