猪链球菌2型在感染猪体内的组织定位和动态分布的研究.doc

猪链球菌2型在感染猪体内的组织定位和动态分布的研究 第28卷第4期 2010年8月 上海交通大学农业科学版JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITYAGRICULTURALSCIENCEVo1.28No.4 Aug.2010 文章编号16719964201004031906D0I10.3969/J.ISSN.16719964.2010.04.004 猪链球菌2型在感染猪体内的组织定位 和动态分布的研究 朱爱玲1,崔立,杨志彪1,蔡雪辉2,王淑杰2,刘永刚2 f1.上海交通大学农业与生物学院,上海200240;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,哈尔滨1500011 摘要为研究猪链球菌2型在感染猪的组织定位和动态分布,本实验采用3O头SPF巴马小型猪,随机分为实验组和对照组. 实验组20头,按照lxl0CFUkg一的剂量肌肉注射ZY05719菌液,对照组10头,按照相同剂量肌肉注射无菌培养基.分别于 攻毒后的12h,1d,2d,3d,4d,5d,6d,7d,8d,10d时处死,剖杀并采集样品扁桃体,淋巴结,肝脏,脾脏,肺脏,肾,脑,制 作冰冻切片,并用特异性免疫荧光抗体染色法和细菌分离方法,观察10日内细菌在各组织内的定位和动态分布情况.结果表 明,细菌主要定殖于扁桃体的隐窝附近;在脾的边缘区和动脉周围淋巴鞘附近,淋巴结的生发中心和皮质内,肝血窦,肺间质和 肾小体中均可见菌体状荧光颗粒;在脑组织中发生脑膜炎的区域,如皮质层等可检出细菌.细菌在肝,肾,肺和脾等实质器官内 呈现相似的动力学,感染后的前3d持续上升,第6天开始下降;在扁桃体内12h就能被检出并持续存在;在脑组织中呈现不 规律分布.实验结果为研究猪链球菌2型的致病机理提供一定依据. 关键词猪链球菌2型;免疫荧光抗体技术;组织抗原定位;组织动态分布 中图分类号855.99文献标识码A LocationandDynamicDistributionofSerotype2 Streptococc..mandOrgansfInfectedSPFPigStreptoCOCCUSSUlSin1issuesanOrganso1ntecteaIFliS.I ZHUAi-ling,CUILi,YANGZhi-biao,CAIXue-hui2,WANGShu-jie2,LIUYong-ganf 1.SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China; 2.HarbinVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150030,China Abstract[Objective]LocationandDynamicdistributionofSerotype2StreptococcusSuisinTissuesandOrgansofInfectedSPF Pigs.[s】30two-montholdSPFpigswererandomlydividedintoexperimentgroupinclude20injectedwithSichuanstrain ZY05719andcontrolgroupinclude10injectedwithasepsismedium.TheSPFpigsweredissectedin12h,1d,2d,3d,4d,5d, 6d,7d,8d,10dafterinjection.Collectthesamplesoftonsil,lymphoidnode,liver,spleen,lung,brainandmakefrozensections, followedbytheobservationsofthelocalization,anddynamicdistributionofSS2invivousingimmunofluorescenceandbacteriaisola- tion.【Results]ThestudyindicatedthatpositiveS.suismainlylocatedintonsilcrypts;thefluorescentcelllikeparticlesalsocanbe seeninthemarginalzoneandperiaeriallymphoidsheathofspleen,thegerminalcenterandcodexoflymphnode,thehepaticsinu soidofliver,interstitiumoflung;andthebacteriaalsopresentedinmeningitisregionofbrain.Dynamicsofbacteriainparenchyma- tousorganssuchasliver,kidney,lungandspleenissimilar.Thenumberofbacteriahadbeenpersistentlyrisingin3daysafterin- fectionanddeclinedafterthe6thday;SS2couldbedetectedinthetonsilin12hafterinjectionandpersisted;butthedistributionin brainisirregular_IConclusion】ThisstudycanbetakenasbasicresearchofSS2pathogenicmechanism. KeywordsStreptococcussuisSerotype2Immunofluorescence;localizationintissues;dynamicdistributing 猪链球菌Streptococcussuis,SS是革兰氏阳性,溶血性兼性厌氧的球菌,是一种重要的人畜共 收稿日期20091201 基金项目①公益性行业农业科V200806016,②863i,ltJ2008AA100804;③兽医生物技术国家重点实验室开放基金 SKLVBF201001④上海市科委2007年度重大科技攻关项H07dz195081 作者简介朱爱玲1986一,女,湖北宜昌人,硕士研究生;崔立1971一,为本文通讯者作,女,博士,副教授,研究方向人兽共患病与 感染模型,,02134206367. 320上海交通大学农业科学版第28卷 患病病原菌,Elliott于1966年在世界上首次正式 报道发现了猪链球菌.猪链球菌根据荚膜多糖抗 原可分为35个血清型,1/2,1,2,7,9和14是导致 动物疾病的主要血清型,其中以2型流行最广.致 病力最强[1-3]. 猪链球菌2型SS2是重要的人畜共患病的病 原,除感染猪,马,猫之外,还可感染人,引起脑膜炎 导致永久性耳聋或复视等后遗症,心内膜炎,败血症 及突发性死亡.SS2感染已成为影响全世界养猪业 的重要问题之一.SS2主要通过伤口或经口感染人, 可引起人链球菌中毒休克综合症STSS和链球菌 脑膜炎综合症SMS,感染引起高热,血管塌陷,血 压过低,休克和多器官衰竭,及高死亡率[4,51.接触 SS2感染病死猪者,诸如生猪屠宰,销售和加工人员 是高危人群,STSS和SMS发病急,发展快,死亡率 高,有的经治疗后虽未危及生命,但却导致永久性耳 聋等后遗症.1998年我国江苏发生的猪链球菌2型 引起的链球菌病造成几十人感染.十余人死亡.2005 年6月到8月在四川省资阳,内江,成都等地暴发猪 链球菌病,其中人感染猪链球菌204例,死亡38 例.这两次由SS2引起的人猪链球菌病大规模爆发 引起全球公共卫生的关注[4-61.目前对SS2的致病 机制的研究尚不明确,尤其是SS2在动物各组织内 的抗原定位和动态分布研究很少.本实验采用特异 性免疫荧光染色的方法对SS2在猪不同脏器组织内 的抗原定位和动态分布进行了研究,为进一步研究 感染机制和致病机理提供依据. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株SS2四川分离株ZY05719由南京农 业大学动物医学院陆承平教授惠赠. 1.1.2实验动物2月龄SPF巴马小型猪,体重4 5kg,由上海交通大学农业与生物学院人兽共患病 与比较医学实验室提供.该猪群未注射任何疫苗,猪 瘟抗体,蓝耳病病毒抗体,口蹄疫病毒抗体,猪圆环 病毒2型抗体,伪狂犬病病毒IgB和IgE抗体,猪流 感病毒H1N1抗体,猪肺炎支原体抗体,弓形虫抗体 布鲁氏菌病抗体,猪乙型脑炎抗体,猪细小病毒抗体 和SS2抗体均为阴性.实验前用ELISA方法检测试 验用巴马小型猪,其SS2抗体均为阴性. 1.1.3试剂和仪器羊抗猪IgG酶标记抗体购自上 海瑞基生物科技公司,工作浓度为12000;FITC异 硫氰酸荧光黄为Merck公司产品;DEAE52纤维素 为Pierce公司产品;荧光显微镜Nr.323778Rejchert Austria;冰冻切片机LeciaGerman;DG一3022A型 酶联免疫检测仪购自南京电子管厂;40孔聚苯乙烯 微量滴定板购自上海塑料制品三厂. 1.2免疫荧光抗体的制备及特异性鉴定 1.2.1SS2高免血清的制备对2头60日龄血检 为SS2阴性的SPF仔猪进行免疫,用2mL浓度为 1109CFUmL一的SS2菌液肌肉注射,共3次,间 隔2周.用ELISA方法监测抗体水平.在第3次免 疫1周后试血,抗体效价达110240,由颈静脉放 血,分离血清,滤过除菌,一20℃保存. 1.2.2SS2高免血清的提纯在SS2高免血清中 加入等量的PBS和一半量的饱和硫酸铵溶液,放置 30min后3000rrain一1离心20min,弃沉淀,以除 去纤维蛋白.在上清液中加入等量的PBS和二倍的 饱和硫酸铵溶液,放置30min后10000rmin-1离 心l0min.取沉淀用PBS恢复至原来的量,再加入 饱和硫酸铵溶液,10000rrain离心10rain后去 上清,重复3次.用PBS溶解沉淀,装入透析袋,在 常水中透析过夜,再在PBS中4cI二透析24h,中间 换液数次.然后用比色法28测定蛋白溶液为.onm 50mg.mL～. 1.2.3荧光素标记特异性抗体取适量抗体溶液 至三角烧瓶中,加入0.5toolL～pH9.5碳酸盐缓冲 液,使最后抗体浓度为20toolL～,碳酸盐缓冲液容 量相当于总容量的1/10.根据标记的抗体总量,按每 毫克蛋白加入0.01mg荧光素,溶于相当于IgG溶 液量1/10的pH9.5碳酸盐缓冲液中,将FITC溶液 在磁力搅拌下,缓慢加入抗体溶液,避免起泡,4℃ 搅伴18h.溶液放入透析袋内,在PBS中透析48h, 滤过大部分游离的F1TC.通过sephadexG50柱除去 剩余游离的FITC,再通过DEAE52柱,以0.01m01. L-1DH7.2PBS洗脱,纯化,浓缩后F/P比为12,分 装,冻干或一20c【保存. 1.2.4荧光抗体工作浓度的鉴定首先取含SS2 的腹股沟淋巴结冰冻切片,将IgGFA分别PBS做 2倍递增稀释,每个稀释度染2片标本.以呈现阳性 荧光的最大稀释倍数作为效价.使用时取2～4个效 价单位. 1.2.5特异性鉴定取未感染SS2仔猪的腹股沟 淋巴结制成冰冻切片,荧光染色并观察结果.另取2 片