荧光原理及荧光光度法2011.ppt

荧光原理及荧光光度法 2011年9月 主要内容 1 荧光的发生2 荧光量子效率和荧光强度3 有机化合物结构与荧光之关系4 环境对荧光的影响5 荧光分析仪器的主要结构 光致发光 物质分子吸收一定能量的光后发射出的光辐射 它大致经过吸收 能量传递及光发射三个主要阶段 第一节 分子荧光基本原理 一 分子荧光的发生过程 一 分子的能级与电子能级的多重性 1 分子的能级跃迁 每个分子具有严格分立的能级 基态分子吸收了特征频率能量后 从低能级向高能级跃迁 即处于不同的激发态 E Ej Ei hv 2 分子的激发态 1 基态时 电子在各原子或分子轨道中成对存在 在某一给定轨道中的两个电子具有相反的自旋 自旋配对 2 所有电子自旋都配对的分子电子态叫基态单重态 S0 基态单重态 S0 3 处于基态单重态的电子对 其中一个电子被激发到某一较高能级时 受激电子的自旋仍然与处于基态的电子配对 称为激发单重态 S 激发单重态 S 4 处于基态单重态的电子对 其中一个电子被激发到某一较高能级时 两个电子的自旋相互平行 称为激发三重态 T 激发三重态 T 激发单重态的平均寿命大约10 8s 而激发三重态的平均寿命大10 4 1s以上 由基态单重态向激发三重态跃迁 S0 T 属于禁阻跃迁 而由基态单重态跃迁到激发单重态 S0 S 是允许跃迁 二 激发态 基态的能量传递途径 S2 S1 S0 T1 吸收 发射荧光 发射磷光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能量 l2 l1 l3 外转换 l 2 T2 内转换 振动弛豫 分子吸收和发射能量转移示意图 辐射跃迁 荧光和磷光 荧光 磷光 是多重度相同 不同 的能级间发生的辐射跃迁发出的光 荧 磷 强度F磷 F荧 讨论 荧 10 6 10 9s 磷 10 4 xs 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光 磷光 强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 二 激发光谱与荧光光谱 1 荧光 磷光 的激发光谱曲线 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光 或磷光强度 与发射光波长关系曲线 图中曲线II或III 2 荧光光谱 或磷光光谱 3 激发光谱与发射光谱的关系 1 Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 发射光谱的波长比激发光谱的长 振动弛豫消耗了能量 2 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 如 2 基态与激发态相应振动能级之间的跃迁几率相近 3 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 与激发光谱形状一样 成镜像对称关系 激发态和基态有相似的振动能级分布 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大 相反跃迁也然 三 物质分子结构与荧光的关系 一 荧光效率 f 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和分子吸收激发光的光量子总数之比 f 0 1 分子产生荧光必须具备的条件 1 具有合适的结构 共轭刚性平面结构 2 具有一定的荧光量子产率 激发态的分子有几种途径可以回到基态 荧光去激发比其它去激发快 才可以观察到荧光发射 荧光效率越大 分子产生荧光的能力越大 二 分子结构与荧光 的荧光效率高 系间跨越过程的速率常数小 有利于荧光的产生 1 跃迁类型 提高共轭程度有利于增加荧光效率并产生红移 2 长共轭效应 共轭程度 f 荧光强度 当激发光波长为 ex327nm时 产生的荧光为 em510nm 维生素A 3 分子的刚性和共平面性 可降低分子振动 减少与溶剂的相互作用 故具有很强的荧光 如荧光素和酚酞有相似结构 荧光素有很强的荧光 酚酞却没有 芳环上有推电子基 使荧光 4 取代基效应 芳环上有吸电子基 使荧光 推电子基 OH NH2 NR2等 吸电子基 NO2 COOH等 引入高原子序数原子 Br I 到 电子体系 荧光减弱 磷光增强 荧光强度对温度变化敏感 温度增加 外转换去活的几率增加 荧光效率 1 温度的影响 除一般溶剂效应外 溶剂的同位素 极性 氢键 配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化 2 溶剂的影响 极性 荧光 重原子溶剂 CBr4 C2H5I 荧光 四 影响荧光的外界因素 弱酸或弱碱性化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 3 溶液的pH值 无荧光 蓝色荧光 无荧光 与荧光物质分子发生相互作用引起荧光熄灭的物质 如 X 重金属离子 O2 NO2 重氮化合物 COOH 等 4 荧光熄灭剂 自熄灭 待测物浓度过大时 会发生分子间碰撞 使荧光强度减弱 称为自熄灭 5 散射光的影响 瑞利光和拉曼光的影响 消除方法 A选择合适的激发波长B选择适当的溶剂 6 激发光源的影响 光可以使某些物质发生分解 第二节半导体的光致发光基本原理 组成物质的分子具有不同的结构因而具有不同的特征频率 光照射于物质时 若光与物质的特征频率相同时 则会发生共振现象 则在该物质的吸收光谱中 在分子所具有的特征频率处出现吸收带 直接带隙和间接带隙半导体 直接禁带半导体 导带的最低能量状态和价带的最高能量状态位于波矢空间同一位置 通常是在k空间原点附近 对这类材料 吸收边附近吸收光子诱发的电子从价带到导带跃迁过程 可以在没有其它准粒子的参与下完成 称之为直接跃迁 间接禁带半导体 导带的最低能量状态和价带的最高能量状态位于波矢空间不同位置 对这类材料 吸收边附近吸收光子诱发的电子从价带到导带跃迁过程 因动量守恒的要求 需要其他准粒子的协助才能完成 称为间接跃迁 跃迁概率较小 附近 半导体的光致发光基本原理 其他跃迁 带内的吸收可以是电子在导带的也可以是空穴在价带的 施主能态到导带的电子跃迁和受主能态到价态的空穴跃迁 半导体发光 半导体中的电子可以吸收一定能量的光子而被激发 处于激发态的电子也可以向较低的能级跃迁 以光辐射的形式释放能量 1 自发辐射 电子和空穴随机结合2 受激辐射 由光激发使电子和空穴的结合 半导体的光致发光基本原理 半导体材料光的吸收和发射 半导体的光致发光基本原理 根据熵最低原理 激发到导带的电子总是最先布居到能量最低的缺陷上 被束缚在缺陷能级上 自发辐射 电子从高能级自发的发射到低能级直接跃迁 间接跃迁 受激辐射 在满足两能级之差的外来光子的激励下 处在高能级的原子以一定的几率自发向低能级跃迁 同时发射一个与外来光子有相同的频率 方向 相位和偏振光子外部辐射可以是其他自发辐射也可以是样品中的受激辐射 并不一定是外部辐射场 受激和自发辐射对比 自发辐射 随机的 发出一串串光波的相位 传播方向 偏振状态都彼此无关 辐射的光波为非相干光 受激辐射的光波 其频率 相位 偏振状态 传播方向均与外来的光波相同 辐射的光波是相干光 ZnO的能带结构和氙灯激发光致发光 阴极射线发光 不同ZnO结构影响发光现象 第三节 稀土发光分析法 无机荧光材料的代表为稀土离子发光及稀土荧光材料 稀土发光是由稀土元素的4f电子在不同能级间跃迁而产生的 如 f f跃迁 f d跃迁 稀土元素和配体之间的跃迁也会产生光辐射 目前研究稀土的荧光上转换是热点 稀土离子或者稀土荧光材料在激发光照射下 产生波长较激发光短的荧光 这种现象被称之为上转换荧光现象 稀土配合物中心离子的窄带发射有利于全色显示 且物理化学性质稳定 目前 常见的无机荧光材料是以碱土金属的硫化物 如ZnS CaS 铝酸盐 SrAl2O4 CaAl2O4 BaAl2O4 等作为发光基质 以稀土镧系元素 铕 Eu 钐 Sm 铒 Er 钕 Nd 等 作为激活剂和助激活剂 基态或激发态吸收能量转移上转换光子雪崩横向弛豫基态或激发态吸收 稀土荧光上转换发光机理 a ground stateabsorption excited stateabsorption GSA ESA b energytransferup conversion ETU c photonavalanche PA NaYF4 Er纳米晶的发光 GSA agroundstateabsorptionESA energytransferupconversionCR crossrelaxation 第四节仪器与技术Fluorometer 一 测量荧光的仪器主要由四个部分组成 激发光源 样品池 双单色器系统 检测器 特殊点 有两个单色器 光源与检测器通常成直角 1 激发光源 2 单色器 光电荧光计常用干涉滤光片 荧光分光光度计常用光栅 特点 强度大 适用波长范围宽 常用 高压汞灯 氙弧灯 卤钨灯 激光光源 3 样品池用石英材料 四面透明 4 检测器光电池或光电倍增管 激发单色器 把不需要的光线滤去 让所选择的激发光透过而照射在测定物质上 选最大激发波长 ex 荧光单色器 把激发光所发生的反射光 溶剂的散射光以及溶液杂质所产生的荧光滤去 只让样品物质所产生的荧光通过而照射到检测器上 选最大荧光波长 em 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧 磷 光光谱图 HITACHIF 4500荧光光谱仪 实例 HITACHIF 4500 仪器光路图 荧光光谱仪HITACHIF 4500 波长范围 200 900nm 分辨率 1nm 波长准确度 2 0nm 扫描速度 15 60 240 1200 2400 12000 30000nm min HITACHIF 4500的基本操作和数据处理方法 打开主电源开关 POWER 按 XeLAMPSTART 两秒松手 黄色灯亮打开弱电源开关 MAIN 上方绿色灯闪烁一次后熄灭开电脑打开桌面上的应用软件 FLSolutions2 0 7 仪器开始初始化 弱电源开关 MAIN 上的绿色灯长亮 初始化完毕 如下工作窗口 右下角有 Ready 的高亮绿色条出现 HITACHIF 4500的基本操作和数据处理方法 8 单击右上角 设置实验方法 弹出如下 窗口 在 General 的 Measurement 中选择 wavelengthscan 进行波长扫描或 3 Dscan 进行3 维扫描 在 Instrument 下拉菜单中 对应 wavelengthscan 和 3 Dscan 填写不同实验工作参数 HITACHIF 4500的基本操作和数据处理方法 wavelengthscan 发射强度 发射波长曲线3 Dscan 发射强度 激发波长 发射波长 3维图 比如 下面是选择 wavelengthscan 测试方法 出现的窗口 接着在 Instrument 下拉菜单中设置相应工作参数 当选择 3 Dscan 后 在 Instrument 下拉菜单中增加设置与激发相关的工作参数 以及采样间隔 Monitor 是进行纵坐标的设置 设置完成后 确定 回到如下窗口 接着进行右边窗口的 pre scan 和 Measure 开始扫描工作 最后保存数据 关机顺序 关计算机关弱电源开关 main 关主电源开关 power 重新打开主电源开关 吹风十分钟 冷却氙灯后关掉主电源开关 盖上遮避尘土的布