1.比较生物的化石及生物化石在地层中存在情况的方法，即运用古生物学上的证据对生物进化进行研究的方法。化石是生物进化最直接和最有力的证据。古生物化石包括动植物的遗体、遗物和遗迹，如恐龙的骨骼、恐龙蛋和恐龙的足迹等。古生物学家在研究化石的过程中发现，各种生物的化石在地层里的出现是有规律的，即在越早形成的地层里，成为化石的生物越简单、越低等；
在越晚形成的地层里，成为化石的生物就越复杂、越高等。这不仅证实了现代的各种各样的生物是经过漫长的地质年代逐渐进化而来的，而且还揭示出生物由简单到复杂、由低等到高等、由水生到陆生的进化顺序。
2.对动物、植物的器官和系统进行解剖和比较研究的方法。比较解剖学为生物进化提供最重要的证据是同源器官。同源器官是指起源相同，结构和部位相似，而形态和功能不同的器官。例如，一些脊椎动物的前肢──鸟的翼、蝙蝠的翼手、鲸的鳍、马的前肢和人的上肢，从外形看，这些器官很不相同，但是它们的内部结构却基本一致。不仅组成一致，而且排列的方式也基本一致（图8）。因此，这些器官都是同源器官。同源器官的存在，证明凡是具有同源器官的生物，都是由共同的原始祖先进化而来的。只是在进化过程中，由于生活环境不同，同源器官适应于不同的生活环境，逐渐出现了形态和功能上的不同。
3.比较和研究动植物的胚胎形成和发育过程的方法。它也为生物进化提供了重要的证据。
一切高等动植物的胚胎发育都是从一个受精卵开始的。这说明高等生物起源于低等的单细胞生物。鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类和人，彼此间的差异十分显著，但是，它们的胚胎在发育初期都很相似，那就是都有鳃裂和尾，头部较大，身体弯曲，彼此不容易区别。只是到了发育晚期，除鱼以外，其他动物和人的鳃裂都消失了，人的尾也消失了（图9）。这种现象说明了高等脊椎动物是从某些古代的低等动物进化而来的，所以在生物的个体发育过程中，迅速重演了它们祖先的主要发育阶段。例如，古代脊椎动物原始的共同祖先生活在水中，所以陆生脊椎动物和人在胚胎发育过程中，还出现鳃裂，等等。
4.比较蛋白质分子差异的方法。生物进化是一种长期渐变的过程，这种渐变除了表现在生物的形态、结构、胚胎发育等生理方面的系统演变外，也同时表现在DNA编码的蛋白质的分子结构上。比较各种生物的同一种蛋白质的氨基酸组成，可以看出生物进化过程中分子结构变化的渐进特征，并以此判断生物之间的亲缘关系和进化顺序。细胞色素C是一种缓慢进化的蛋白质，常用作比较生物进化和分类的依据。
细胞色素C是一种具有104～112个氨基酸的多肽分子。从进化上看，细胞色素C是一种很保守的分子，据科学家估计，它的氨基酸顺序每200万年才发生1的改变。正因为细胞色素C分子变化的缓慢和保守，所以它在进化中才能够被保留下来。不同生物的细胞色素C中氨基酸的组成和顺序反映这些生物之间的亲缘关系。在所查的几十种生物中，细胞色素C分子中有27个氨基酸残基是相同的，其余的氨基酸残基则随生物的不同而有不同的差异。这些差异的不同说明生物之间的同源性程度，差异越小，表明亲缘关系越近，差异越大，表明亲缘关系越远。下表是几种生物和人的组成细胞色素C的氨基酸之间的差异。
十种生物与人的细胞色素C的氨基酸组成的差异 生物名称 与组成人的细胞色素C的氨基酸的差别 黑猩猩 0 猕猴 1 狗 11 马 12 鸡 13 金枪鱼 21 果蝇 27 向日葵 38 链孢霉 43 螺旋菌 45 从表中可以看出，黑猩猩与人的亲缘关系最近，其次是猕猴，螺旋菌与人的亲缘关系最远。根据细胞色素C的差异所绘制出的生物界的系统树，与根据化石、比较形态学制成的系统树是一致的。