Chromabond C18固相萃取小柱M acherey- Nagel公司德国。
二 试验试剂 4-嗅甲基-7-甲氧香豆素BM C、18-冠醚-6DCC，α-鼠胆酸α-MCA ,β-鼠胆酸β-M CA、熊脱氧胆酸U DCA、胆酸CA、猪脱氧胆酸H DCA 、脱氧胆酸DCA、鹅脱氧胆酸CDCA、甘氨胆酸GCA、甘氨鹅脱氧胆酸 GCDCA标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。甲醇、乙睛色谱纯，美国天地公司，月桂酸分析纯，上海化学试剂公司，氢氧化钾、磷酸二氢钾分析纯，成都化学试剂厂. 三 色谱条件 流动相A相，甲醇乙睛为12V/V；
B相，超纯水；
梯度洗脱程序65A 08min，80 A816 min，90 A1620 min；
柱温20℃；
流速1 mL/ min;激发波长330nm；
发射波长400nm。
四 样品处理 样品预处理取鼠胆汁20μL，加入120μmol/ L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2 mL，充分混匀，超声20 min, 10 000 g离心10 min，取上清液，在60℃氮气下吹干。
胆汁酸的提取测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲液pH 7，加至已活化的固相萃取 C18小柱上用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化C18小柱，再用10 mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向 预处理吹干后的胆汁样品中加入1 mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液pH 5.6 0.5 mL,避光37℃反应30 min，再加入O.5 mol/ L磷酸盐缓冲液pH 7 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸. 胆汁酸的衍生与测定向胆汁酸洗脱液中加入150 μL 1. 8 mmol/ L KOH甲醇液于60 ℃氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BM C乙睛液与5 mmol/ L DCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析. 二、 高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸 一 试验仪器 AP I 2000质谱仪加拿大A pplied Biosystens公司，配备Perk in E Inmer 200泵和tubro离子源;A tlantisdC18色谱柱，150 mm X 3.9 mm, 5μm美国Waters公司，保护柱及C18柱芯美国Phenan enex公司，Chrcm abond C18 ec 3 mL /200 m g德国M achere-N agel公司，M illpore纯水装置美国M illpore公司。15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯Sigma公司;甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯美国Tedia公司。
二 试验试剂 15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯Sigma公司;甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯美国Tedia公司。
三 色谱条件 柱温25℃；
流速1 m L /min分流比为14；
流动相A 5 mm o 1/L醋酸铵和0.O1甲酸水溶液；
B 5 mm o 1/L醋酸铵和0 O1甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序为Omin（80 B9min97.0 B 10 m in 80 B 15 m in 80 B 。
四 样品处理 蛋白沉淀法800 μL乙睛中加入300 μL血清，混匀1 min,超声30min以15000 X g离心15min,取900μL上清液60℃氮气吹干，其余同固相萃取。
固相萃取法依次用1 mL甲醇,1mL0.05甲酸溶液活化固相萃取小柱。1 mL 0.05甲酸溶液中加入300μL血清，混匀1 min后上小柱。依次用1 m L 0.05甲酸溶液、1 mL甲醇水溶液 45 55, V /V冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于100 μL流动相A B 20 80，V/V中，漩涡混匀lmin超声2min。取20 μL进行H PLC-MSIMS分析，检测时间15min。
三、 高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸 一 试验仪器 Shimadzu 2010LC- AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器日本Shimadzu公司;Aglient固相萃取装置美国Aglient公司;Millipore纯水装置美国Millipore公司；
Chromabond C18固相萃取小柱德国Maeherey- Nagel公司；
牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA、牛磺胆酸CTaurocholic acid TCA、甘氨胆酸Glycocholic acid,GCA、甘氨石胆酸Glycol-ithochdic acid, GLCA、甘氨脱氧胆酸Glycodeoxycholic acid,GDCA牛磺脱氧胆酸CTaurodeoxycholic acid TDCA、甘氨鹅脱氧胆酸Glycochenodeoxycholic acid GCDCA、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholic acid, TCDCA、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid TLCA标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛色谱纯，美国Tedia公司，其余试剂均为分析纯。
二 试验试剂 牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA、牛磺胆酸CTaurocholic acid TCA、甘氨胆酸Glycocholic acid,GCA、甘氨石胆酸Glycol-ithochdic acid, GLCA、甘氨脱氧胆酸Glycodeoxycholic acid,GDCA牛磺脱氧胆酸CTaurodeoxycholic acid TDCA、甘氨鹅脱氧胆酸Glycochenodeoxycholic acid GCDCA、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholic acid, TCDCA、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid TLCA标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛色谱纯，美国Tedia公司，其余试剂均为分析纯。
三 色谱条件 谱柱为Waters Nova C18柱3.9 mm x 150mm, 5μm，流动相为甲醇一60 mmol/L磷酸盐缓冲液6634,v/v ,pH 3.3，等度洗脱，柱温25℃，流速0.8 ml/min;检测波长197 nm，进样量为10 μL。
四 样品处理 方法1取胆汁样品25μL，加入乙睛2.5 ml，旋涡震荡混匀，超声20 min,10 000g/min离心10min，取上清液2 ml, 60℃氮气下吹干。将预处理吹干后的汁样品溶于2 ml 0.5 mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.0，加至己活化的固相萃取C18小柱上预先用2 ml甲醇和5 ml蒸馏水依次活化C18小柱，再用10 ml蒸馏水淋洗小柱，最后用3 ml甲醇洗脱胆汁酸。洗脱液在60℃氮气下吹干后溶于200μL流动相，超声30 s,lOμL 进样。
四、 血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定 一 试验仪器 1100型高效液相色谱-质谱联用仪Agilen t公司，配备四元梯度泵，100位自动进样器，荧光检测器，在线真空脱气机，大气压化学电离源APCI; H ypersil C18色谱柱4.6 mm X 200 mm, 5μm,中国科学院大连化学物理研究所。1, 2-苯并-3,4-二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯自制;胆汁酸标准样品Sigma公司;无水乙睛禹城化学试剂厂，用P2O5干燥后蒸馏处理，二甲基亚矾经减压蒸馏后备用;柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯，实验用水由M illi-Q超纯水系统制备。
二 试验试剂 标准溶液的配制准确称取定量胆汁酸标准品，用乙睛配成0.001mol/L的溶液。称取208.5 m g的1, 2-苯并-3,4二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯 BDETS用二甲基亚矾定容至l Om L,浓度为0.05 mo1/L。相 应低浓度的衍生试剂500μmol/L标准溶液用二甲基亚矾稀释，低浓度胆汁酸50μmol/L标准溶液用无水乙睛稀释而成。
三 色谱条件 色谱柱H ypersil C18色谱柱4.6 mm X 200 mm, 5μm 。流动A 50乙睛水溶液含有40 mm o 1/L的HCOONH4, pH 3.5; B 100的乙睛。梯度洗脱程序为0B 35 min线性梯度到70B到40 min线性梯度到10plo B, 100B再运行15min流速为1.0mL/min柱温300℃。荧光激发波长和发射波长分别为 λex 333 nm, λem390 nm. 质谱条件1100型高效液相色谱领谱联用仪;大气压化学电离源APC I，正离子模式，喷雾压力0.42 M Pa;干燥气流量为5 L /min燥气温度350℃，气化温度450℃;毛细管电压3500V，电晕电流4000nA 四 样品处理 标准品的衍生过程盛有500 m g柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DM S0, 50 μL混合胆汁酸溶液，150 μL衍生试剂溶液，封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30min取出放冷后加入300 μL乙睛混合均匀，取上层溶液用乙睛水溶液CH3CN /H20, 11, V/V稀释5倍直接进样分析。
血清中胆汁酸的提取向盛有2 mL血清样品的离心试管中加入3 mL甲醇并振荡摇匀，然后加入0.5g硫酸按固体超声振荡，离心后取出有机相用氮气吹干，剩余物用300 mL DM SO溶解后加入6.7 mL水。然后用经过4m L甲醇和5m L水冲洗的C18 Sep-Pak萃取柱过滤，再用5 mL水冲洗萃取柱，然后用5 mL乙睛将胆汁酸洗脱，将洗脱液挥发至干用300 mL DMSO溶解冷藏备用。
五、 柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中9种胆汁酸 一 试验仪器 LC-6A高效液相色谱仪，RF-535荧光检测器日本，岛津公司;玻璃管均硅烷化。
二 试验试剂 胆酸CA、脱氧胆酸DCA、鹅脱氧胆酸CDCA、熊脱氧胆酸U DCA、石胆酸LCA、甘氨胆酸 GCA、甘氨脱氧胆酸GDCA、甘氨鹅脱氧胆酸GCDCA、甘氨石胆酸GLCA Sigma aldrich公司。BM C4-溴甲基-7-甲氧基香豆素,DCC18-冠醚-6 Sigma aldrich公司，甲醇、乙睛色谱纯，美国天地公司，氢氧化钾、磷酸二氢钾、月桂酸均为国产分析纯。
三 色谱条件 Waters Nova C18色谱柱3.9 X 150 mm, 5 μm。柱温25