CN102972355A利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法

10 申请公布号 CN 102972355 A 43 申请公布日 2013 03 20 CN 102972355 A CN102972355A 21 申请号 201210518077 9 22 申请日 2012 12 05 A01K 67 033 2006 01 A01H 4 00 2006 01 71 申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 72 发明人 谢辉 徐春玲 李宇 丁莎 李克梅 74 专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 苏运贞 54 发明名称 利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生 线虫的方法 57 摘要 本发明公开了一种利用甘薯愈伤组织繁殖培 养和保存植物寄生线虫的方法 本发明通过以下 步骤实现 新鲜甘薯经洗净 表面消毒 削皮和切 片放入培养皿后在培养箱中培养获得甘薯愈伤组 织 取经消毒处理的植物寄生线虫接种到甘薯愈 伤组织上 分别放在各自适宜温度的培养箱中黑 暗培养繁殖 培养一段时间后 将植物寄生线虫 连同甘薯愈伤组织于 4 20 保存 本发明方法 可实现即简单 大量人工培养繁殖植物寄生线虫 又能长期保存植物寄生线虫资源的目的 51 Int Cl 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 19 中华人民共和国国家知识产权局 12 发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1 1 页 2 1 一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征在于包括以下 步骤 1 甘薯愈伤组织的制备 将新鲜健康的甘薯洗净晾干 用酒精浸泡后 灼烧 至表皮变 暗 削去表皮 切成甘薯片 放入灭菌培养皿中 封口 于 22 28 暗培养至长出甘薯愈伤 组织 2 植物寄生线虫的消毒和接种 挑取或吸取植物寄生线虫 消毒 然后离心 去除上 清 将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心 去除上清 最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分散 滴在甘薯愈伤组织上 封口 3 植物寄生线虫的繁殖培养 将步骤 2 中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组织进 行暗培养繁殖 培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度 4 植物寄生线虫的保存 将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于 4 20 保存 2 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 1 中所述的酒精为质量百分比 70 的工业酒精 步骤 1 中所述的浸泡的时间 为 2min 3 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 1 中所述的甘薯片厚度为 4mm 步骤 1 中所述的培养皿的直径为 6cm 步骤 1 中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口 步骤 1 中所述的于 22 28 暗培养 至长出甘薯愈伤组织的时间为 10 15 天 4 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 2 中所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫 Ditylenchusdestructor 起绒草茎 线虫 D dipsaci 或香蕉穿孔线虫 Radopholus similis 5 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 2 中所述的消毒为使用质量百分比 0 2 的硫酸链霉素溶液处理 3 12h 6 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 2 中所述的离心的条件为 4000rpm 离心 2min 7 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 3 中所述的培养温度具体如下 当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时 所述 的培养温度为 20 25 当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时 所述的培养温度为 17 20 当所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时 所述的培养温度为 25 30 8 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 4 中所述的植物寄生线虫为在甘薯愈伤组织上培养 50 天的植物寄生线虫 9 权利要求 1 所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 其特征 在于 步骤 4 中所述的保存的温度如下 所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫或起绒草茎 线虫时 所述的保存的温度为 4 所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时 所述的保存的 温度为 20 10 权利要求 1 9 任一项所述的利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的 方法 其特征在于 包括线虫继代培养的步骤 具体为在接种扩增繁殖线虫的甘薯愈伤组织 培养皿中加入无菌水 然后挑出或吸取线虫 重复权利要求 1 的步骤 2 和 3 即可达到继 代培养之目的 权 利 要 求 书 CN 102972355 A 2 1 5 页 3 利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物寄生线虫的繁殖培养和保存方法 具体涉及一种利用甘薯愈伤组 织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 背景技术 0002 对于植物寄生线虫 要研究其系统分类 分子生物学 功能基因组学以及蛋白质组 学等基础研究 或者在实验室和田间进行生物学 病理学以及防治方法等基础和应用研究 都需要大量 纯化的线虫 然而 植物寄生线虫大多都是专性寄生的 很难在纯培养基上培 养 只能在相应的寄生植物上繁殖 在实际中 人们往往利用植物组织培养技术在 White 1963 Krusberg 1961 和 Gamborg s B5 等植物组织培养基或 1 水琼脂培养基上 培 养新鲜的植物愈伤组织 离体根或其他一些植物器官及整株植物幼苗 然后在这些植物材 料上接种培养繁殖植物寄生线虫 兼食真菌的植物线虫 也可以用某些种类的真菌菌丝来 培养 冯志新 2001 不同类型线虫的培养所采用的具体方法取决于其生物学特性 0003 腐烂茎线虫 Ditylenchus destructor 起绒草茎线虫 D dipsaci 和香蕉穿孔 线虫 Radopholus similis 都是迁移性内寄生线虫 严重为害多种作物 均被我国列为检 疫性植物有害生物 对腐烂茎线虫和起绒草茎线虫 目前可利用在培养基上培养的紫花苜 蓿愈伤组织或真菌进行人工培养繁殖 对香蕉穿孔线虫 则利用在培养基上培养的紫花苜 蓿愈伤组织和胡萝卜愈伤组织或利用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织 进行人工培养 繁殖 但是利用培养基培养植物愈伤组织或真菌 再接种培养繁殖线虫 操作复杂 同时易 发生污染导致繁殖成功率和繁殖量低 直接用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织繁殖和 培养保存香蕉穿孔线虫的方法 也因胡萝卜含水量大 易带内生细菌发生腐烂 存在不能长 期培养保存等缺陷 发明内容 0004 为克服现有技术的缺点与不足 本发明的目的在于提供一种利用甘薯愈伤组织繁 殖培养和保存植物寄生线虫的方法 该方法可实现即简单 大量人工培养繁殖线虫 又长期 保存线虫资源的目的 0005 本发明的目的通过以下技术方案实现 一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植 物寄生线虫的方法 包含以下步骤 0006 1 甘薯愈伤组织的制备 将新鲜健康的甘薯洗净晾干 用酒精浸泡后 灼烧 至表 皮变暗 削去表皮 切成甘薯片 放入灭菌培养皿中 封口 于 22 28 暗培养至长出甘薯 愈伤组织 0007 2 植物寄生线虫的消毒和接种 挑取或吸取植物寄生线虫 消毒 然后离心 去除 上清 将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心 去除上清 最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分 散滴在甘薯愈伤组织上 封口 0008 3 植物寄生线虫的繁殖培养 将步骤 2 中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组 说 明 书 CN 102972355 A 3 2 5 页 4 织进行暗培养繁殖 培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度 0009 4 植物寄生线虫的保存 将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于 4 20 保存 0010 步骤 1 中所述的酒精选用工业酒精即可 其浓度优选为质量百分比 70 0011 步骤 1 中所述的浸泡的时间优选为 2min 0012 步骤 1 中所述的甘薯片的厚度根据培养皿的厚度 以距离皿盖至少 5mm 为宜 优 选厚度为 4mm 太厚靠近皿盖 不易于接种 太薄容易缺失水份 薯块易干 不易于长期培养 繁殖率低 0013 步骤 1 中所述的培养皿可以是多种规格 优选直径为 6cm 的培养皿 培养皿大 太占用空间 太小则只放较小的薯块 不利于提高线虫的繁殖率 此外 6cm 的培养皿便于保 存 0014 步骤 1 中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口 0015 步骤 1 中所述的暗培养的温度更优选为 25 0016 步骤 1 中所述的于22 28 暗培养至长出甘薯愈伤组织的时间一般为10 15 天 0017 步骤 2 中所述的植物寄生线虫优选为腐烂茎线虫 Ditylenchus destructor 起绒草茎线虫 D dipsaci 或香蕉穿孔线虫 Radopholus similis 0018 步骤 2 中所述的消毒优选为使用质量百分比 0 2 的硫酸链霉素溶液处理 3 12h 可以达到消毒目的 不影响其正常的繁殖发育 0019 步骤 2 中所述的离心的条件优选为 4000rpm 离心 2min 0020 步骤 3 中所述的培养温度要根据被培养繁殖的植物线虫种类的生物学特性确 定 因为植物寄生线虫不同属 种间的生物学特性存在差异 最合适的生长温度有所不同 0021 当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时 所述的培养温度为 20 25 0022 当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时 所述的培养温度为 17 20 0023 当所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时 所述的培养温度为 25 30 0024 步骤 4 中所述的植物寄生线虫优选为在甘薯愈伤组织上培养 50 天的植物寄生 线虫 0025 步骤 4 中所述的保存的温度如下 所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫和起绒草 茎线虫时 所述的保存的温度为 4 所述的植物寄生线虫为香蕉穿孔线虫时 所述的保存 的温度为 20 0026 上述利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 包括线虫继代培养 的步骤 是在接种扩繁线虫的甘薯愈伤组织培养皿中加入无菌水 然后挑出或吸取线虫 重 复步骤 2 和 3 即可达到继代培养之目的 0027 与现有技术相比 本发明具有以下优点和有益效果 目前 利用甘薯愈伤组织繁殖 和培养保存腐烂茎线虫 Ditylenchus destructor 起绒草茎线虫 D dipsaci 或香蕉穿 孔线虫 Radopholus similis 这 3 种植物寄生线虫的方法尚未有报道 本专利发明利用 无培养基培养的甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法 操作简单 成功率和 繁殖率高 并且也可以实现对这 3 种线虫的更长时间的保存 本发明的方法既可实现简单 大量繁殖腐烂茎线虫 起绒草茎线虫和香蕉穿孔线虫 又能长期培养保存这些线虫 具体如 下 说 明 书 CN 102972355 A 4 3 5 页 5 0028 1 使用甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫 与真菌培养方法相比 操 作方法更加简便 培养材料更易获得 培养一段时间的线虫比较容易聚集在培养皿底部 容 易收集干净的线虫 此外 腐烂茎线虫和起绒草茎线虫属于植物寄生线虫 长期在真菌上培 养会导致其对植物寄生和致病力的退化 在甘薯愈伤组织长期培养则能避免此情况发生 0029 2 使用无需培养基培养的甘薯愈伤组织培养腐烂茎线虫和起绒草茎线虫 与用 培养基培养的苜蓿愈伤组织培养这两种线虫的方法相比 操作步骤简单 对人员操作要求 低 省时 省力 且成功率高 主要表现在 1 本发明不需要配制培养基 2 甘薯愈伤组织一 般在 7 天就可以长出 10 15 天则可以在薯块上长满薯块 但用培养基培养的苜蓿愈伤组 织需要 1 个月 3 甘薯的切片规则 有一个愈伤组织平面 容易接种线虫 而苜蓿愈伤组织 不规则 不易接种线