西兰花种子发芽过程中生理活性物质含量的变化_郭丽萍

西兰花种子发芽过程中生理活性物质含量的变化 郭丽萍 1 2 王志英 1 杨润强 1 顾振新 1 1南京农业大学食品科技学院南京210095 2青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛266109 摘要以西兰花种子为试材 测定不同品种西兰花种子中萝卜硫苷和萝卜硫素含量 分析选取的种子在发芽过 程中抗坏血酸 总酚 花色苷 萝卜硫苷 黑芥子酶活性和萝卜硫素含量的变化 结果表明 10种西兰花种子中萝 卜硫苷和萝卜硫素含量差异显著 两者在LX5种子中含量最高 分别为134 06 mol g DW和11 37 mg g DW 且硫苷水解的产物中萝卜硫素的含量最高 LX5中 抗坏血酸在发芽过程中逐渐生成 发芽4 d时高达127 49 mg 100 g FW 随后逐渐下降 总酚在发芽过程中逐渐下降 发芽5 d时其含量下降42 14 花色苷含量与抗坏 血酸含量变化趋势基本一致 萝卜硫苷和萝卜硫素含量在发芽过程中呈下降趋势 黑芥子酶活性在0 3 d无显 著变化 随后逐渐增强 关键词西兰花种子 发芽 萝卜硫苷 萝卜硫素 文章编号1009 7848 2016 03 0160 08doi 10 16429 j 1009 7848 2016 03 022 西兰花 Brassica oleracea L var italica 又 称青花菜 绿花菜 是十字花科芸薹属一年生植 物 与花椰菜和结球甘蓝同为甘蓝的变种 研究表 明 西兰花含有丰富的维生素E 维生素C 膳食 纤维 多酚 花色苷 类胡萝卜素 硫代葡萄糖苷 简称硫苷 等重要活性物质 被称为天然的抗氧 化蔬菜 1 2 经常摄入有助于预防胃癌 肺癌 膀胱 癌 乳腺癌 前列腺癌 胰腺癌等各种癌症的发 生 3 这主要是因为在西兰花中含有丰富的硫苷 其在黑芥子酶的作用下生成的异硫氰酸酯具有显 著的抗癌活性 1 西兰花中含量最高的硫苷是4 甲基亚磺酰基丁基硫苷 glucoraphanin 也称为萝 卜硫苷 当西兰花被咀嚼 粉碎时 萝卜硫苷与黑 芥子酶接触 被水解成具有生理活性的萝卜硫素 4 萝卜硫素是目前发现的抗癌活性最强的异硫氰酸 酯 除了其显著的抗癌功效外 还具有消炎 5 抑 菌 6 预防心血管疾病 7 等功效 西兰花芽苗因其丰富的营养及保健功能而受 到人们的喜爱 日本 欧美等发达国家已有食用的 习惯 8 研究表明 西兰花芽苗中萝卜硫苷和萝卜 硫素的含量是成熟西兰花的10 100倍 9 因此得 到广泛的关注 10 12 目前国内关于西兰花芽苗的研 究较少 国外也主要集中于硫代葡萄糖苷的研究 对于西兰花种子发芽过程中生理活性物质的变化 还未见报道 本文选择萝卜硫苷和萝卜硫素含量 较高的西兰花种子 研究其发芽过程中抗坏血酸 总酚 花色苷 萝卜硫苷 黑芥子酶活和萝卜硫素 含量的变化 为西兰花芽苗的研究及功能性食品 开发提供理论依据 1材料与方法 1 1材料与设备 1 1 1试材西兰花种子 品种 狼眼 LY 翠绿 80 d CL80 绿翠75 d CL75 惠绿早生 HLZS 碧玉 BY 文兴 WX 曼陀绿 MTL 优秀 YX 绿秀 LX 绿雄5号 LX5 均购自南京理想种苗 有限公司 1 1 2试剂萝卜硫素 烯丙基硫苷 硫酸酯酶 抗坏血酸 美国Sigma公司 DEAE Sephadex A 25树脂 咪唑 北京索莱宝科技有限公司 乙腈 色谱纯 上海陆都化学试剂厂 二氯甲烷 福林 酚 草酸 甲醇 乙醇 没食子酸 醋酸钠 盐酸 氢 氧化钠 乙酸等 分析纯 国药集团上海化学试剂 公司 牛血清白蛋白 BSA 考马斯亮蓝G 250 收稿日期 2015 03 09 基金项目 国家自然科学基金项目 31271912 作者简介 郭丽萍 女 1981年出生 博士 讲师 通讯作者 顾振新E mail guzx Vol 16 No 3 Mar 2 0 1 6Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology 中 国 食 品 学 报 第16卷第3期 2 0 1 6年3月 第16卷 第3期 生化试剂 国药集团上海化学试剂公司 1 1 3仪器设备Orion818型pH计 美国Orion Research Inc 755B型分光光度计 上海精密科学 仪器有限公司 Agilent 1200液相色谱仪 美国安 捷伦公司 TDL 40B离心机 上海安亭科学仪器 厂 P62X 150智能光照培养箱 宁波海曙赛福实 验仪器厂 HH 6型数显恒温水浴锅 常州国华电 器有限公司 1 2西兰花种子发芽条件 称取西兰花种子 于1 5 次氯酸钠溶液中浸 泡15 min 然后用蒸馏水冲洗 直至中性pH 然后 于去离子水中30 浸泡4 h 置于铺有蛭石的小 盒中 放置于带有自动喷雾的发芽机中 于25 条件下发芽 16 h光照 8 h黑暗 催芽1 d后 停止 喷雾 以后每天喷去离子水2次 分别发芽 1 2 3 4 5 6 7 d后取样 清洗后用吸水纸吸干水 分 用液氮速冻 于 80 冰箱中贮存待用 1 3测定指标与方法 1 3 1抗坏血酸含量根据Volden等 13 的方法作 适当修改 取0 2 g芽苗 用4 mL 2 草酸研磨提 取 匀浆液于10 000 g离心15 min后收集上清液 过0 45 m膜 HPLC测定 HPLC条件 色谱柱 SB C18色谱柱 检测波长 254 nm 流速 0 8 mL min 柱温 30 进样量 20 L 流动相 0 1 草酸 甲醇 95 5 1 3 2总酚含量取0 2 g芽苗 用5 mL 50 甲醇 研磨匀浆 匀浆液于10 000 g离心15 min后收集 上清液 取1 mL上清液 加入1 mL 0 2 mol L福 林酚试剂和2 mL 2 Na2CO3 室温避光反应2 h 后 于765 nm处测定吸光值 用没食子酸作标准 曲线 计算出样品中总酚含量 1 3 3花色苷含量测定根据Fuleki和Francis 14 的方法作适当修改 取0 2 g芽苗 用4 mL酸化 乙醇 95 乙醇与1 5 mol L HCl体积比为85 15 研磨提取 匀浆液于10 000 g冷冻离心15 min后 收集上清液 于535nm处测定吸光值 花色苷含 量按照下式计算 花色苷含量 mg 100g FW A535 V 98 2 W 100 式中 A535nm 吸光值 V 定容体积 mL 98 2 花色苷在535 nm处的平均消光系数 W 样品质量 g 1 3 4硫代葡萄糖含量根据Font等 15 的方法 并作适当修改 准确称取0 50 g样品加入2 mL煮 沸的75 甲醇 80 恒温水浴中浸提15 min 10 000 r min离心10 min 收集上清液 沉淀再用 2 mL 75 的甲醇提取一次 合并上清液 取1 mL 上清液流经DEAE SephadexTM A 25离子交换 柱 待提取液全部排干后 用2 mL 0 02 mol L醋 酸钠分2次冲洗柱子 然后加入200 L硫酸酯 酶 于35 下反应16 h后 用4 mL去离子水洗 脱 洗脱液经0 45 m滤膜过滤后用于HPLC分 析 HPLC分析条件 色谱柱为Eclipse XDB C18 column 5 m 4 6 150 mm Agilent Technolo gies Co Ltd USA 流动相为超纯水和20 乙 腈 先用水洗脱1 min 1 21 26 min内乙腈浓度 线性梯度为0 100 0 检测波长为226 nm 流速为1 mL min 柱温30 进样量20 L 以烯 丙基硫苷 sinigrin 作为内标 1 3 5萝卜硫素含量采用GU等 11 的方法并稍 做修改 准确称取0 10 g种子及0 50 g芽苗 加入 4 mL蒸馏水 于37 水解4 h 加入3 mL二氯甲 烷萃取 二氯甲烷相旋转蒸发后用3 mL 10 乙腈 溶解 过0 45 m膜 HPLC测定 HPLC条件 色 谱柱为EclipseXDB C18色谱柱 检测波长 254 nm 流速为0 6 mL min 柱温30 进样量20 L 洗脱程序 0 min 25 min 30 min 10 乙腈 60 乙腈 100 乙腈 1 3 6黑芥子酶活性根据Kim等 16 的方法并稍 作修改 取0 5 g西兰花芽苗 用3 mL 0 1 mol L pH 6 5磷酸盐缓冲液冰浴研磨 4 10 000 g离 心15 min 上清液即为粗酶液 取粗酶液0 5 mL 与0 5 mL 0 1 mol L烯丙基硫苷混合 于37 水 浴反应15 min后沸水灭酶5 min 以葡萄糖试剂 盒测定葡萄糖的含量 以每分钟被黑芥子酶转化 生成1 nmol葡萄糖为1个酶活力单位 酶活单位 为U mg protein 1 4数据统计与分析 试 验 数 据 采 用 统 计 分 析 软 件18 0 SPSS 18 0 进行统计分析 均值间比较采用Duncan s多 重比较 在0 05水平上进行显著性检验 西兰花种子发芽过程中生理活性物质含量的变化161 中 国 食 品 学 报 2016年第3期 化合物名称保留时间 min分子式分子质量种子中各成分相对含量 3 丁烯基异硫氰酸酯8 298C5H7NS11313 253 4 甲硫基丁腈11 758C5H9NS1156 421 丁基异硫氰酸酯14 978C5H9NS1155 346 萝卜硫腈16 096C6H11NOS1458 374 萝卜硫素19 128C6H11NOS217766 605 表1LX5种子酶解产物的GC MS检测结果 Table 1The GC MS analysis result of hydrolysis products from broccoli seeds 2结果与分析 2 1西兰花品种的筛选 2 1 1不同品种西兰花种子萝卜硫苷和萝卜硫素 含量的比较由图1可以看出 本研究中选取的 10个品种的西兰花种子中的萝卜硫苷和萝卜硫 素含量呈现出了极大的差异性 种子中的萝卜硫 苷含量为7 11 134 06 mol g DW 萝卜硫素含量 为0 12 11 37 mg g DW 其中 绿雄5号 LX5 是 萝卜硫苷和萝卜硫素含量最高的品种 萝卜硫苷 含量是其它品种的2 18倍 萝卜硫素含量是其它 品种的4 50倍 其中 MTL和YX虽然萝卜硫苷 含量相对较高 但是萝卜硫素含量却低于LY BY 和WX等品种 原因可能是MTL和YX种子中黑 芥子酶的活性较低 或者ESP蛋白的活性较高 因 为ESP蛋白的存在 导致了萝卜硫苷转化为萝卜 硫腈 而降低了萝卜硫素的含量 17 品种之间的差 异性在很多研究中得到了证实 P rez Balibrea 18 等研究了3个品种的西兰花种子中萝卜硫苷含 量 含量在118 7 327 3 mg 100 g FW GU 11 等研 究了7个品种的西兰花种子中萝卜硫素的含量 为0 3 46 mg g DW 因此 LX5是萝卜硫苷和萝 卜硫素含量都较高的品种 选用该品种进行后续 试验 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 萝卜硫苷含量 mol g DW 1 LY CL80 CL75 HLZS BY MTL WX LX YX LX5 西兰花种子 a bc de dd e c bb f a 萝卜硫素含量 mol g DW 1 14 12 10 3 2 1 0 b b f bc c d e g h a LY CL80 CL75 HLZS BY MTL WX LX YX LX5 西兰花种子 b 图1不同品种的西兰花种子中萝卜硫苷 a 和萝卜硫素 b 的含量 Fig 1The contents of glucoraphanin a and sulforaphane b in seeds of different broccoli cultivars 2 1 2LX5种子酶解产物GC MS鉴定结果由 表可以看出 在LX5种子中检测到3种异硫氰酸 酯 分别为1 丁烯基异硫氰酸酯 丁