2．对不按要求填报本中期检查书，或项目执行不力，或研究内容调整不当而影响项目顺利开展的，学校将中止拨款。
3．院系专家组认真评审，签署意见后，按时将本检查书一式二份报送项目管理办公室。
一、项目主要进展（附已发表论文首页或其他成果的复印件） （一） 项目研究已完成如下工作 1. 项目前的资料查找搜集以及实验所需实验器材药品的申报；
2. 从猪肠道内容物以及乳制品中分离、纯化、筛选得到多株芽孢杆菌和乳酸菌；
3. 耐受性试验 对筛选出的芽孢杆菌进行耐受性试验（人工胃液、人工肠液）；
4. 初筛 对初筛得到的乳酸菌和耐受性强的芽孢杆菌做牛津杯法抑菌试验，指示菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、李斯特菌；
5. 复筛 产细菌素乳酸菌的复筛，主要有酸及酸性末端产物作用的检测与排除、过氧化氢作用的检测与排除；
6. 对已筛得的具有抑菌性的9株芽孢杆菌做滤纸片法测其对抗生素的敏感性，抗生素有杆菌肽、头孢、红霉素、四环素；
7. 对筛选得到的产细菌素的芽孢杆菌进行了形态鉴定，革兰氏染色并获得镜检图像。
（二）主要研究内容及成果 1.实验技术路线图 试样的采集 ↓ 芽孢杆菌、乳酸菌的筛选纯化 ↓ 芽孢杆菌耐受试验 ↓ 初筛（牛津杯抑菌试验 ↓ 乳酸菌复筛 ↓ 复合益生菌发酵液的抑菌活性试验 ↓ 小型试验 产生菌的最佳培养条件、生物学特性研究、菌种鉴定、 2.芽孢杆菌及乳酸菌的分离及纯化 2.1芽孢杆菌预筛选和增殖培养 称取猪粪5 g,分装到5支灭菌生理盐（20mL）试管中,制备菌悬液（配置0.85 的生理盐水稀释液200mL，一个三角瓶放180mL，另取两只试管各放9mL）取用10-4和10-5菌液。每个稀释度吸取200 μL均匀涂布于芽孢杆菌培养基倒置培养361℃，72h。
LBG（产芽孢杆菌的培养基） 0.3葡萄糖、1蛋白胨、0.5酵母膏、1氯化钠 0.2琼脂粉 2.2乳酸菌的分离与筛选 取5克猪肠道内容物样品,用无菌生理盐水进行梯度稀释,选取110-2 、110-3、110-4、110-5四个稀释度，每个稀释度吸取200 μL均匀涂布于MRS固体平板表面，每个稀释度做两个平行,置于361℃培养3-5 d,挑取单菌落并连续3次划线分离，得到分离菌株。
MRS液体培养基葡萄糖20ɡ/L; 蛋白陈10ɡ/L; 酵母提取物5 ɡ/L；
柠檬酸二铵2ɡ/L; 醋酸钠5ɡ/L; 牛肉膏10ɡ/L;吐温801ɡ/L; K2HPO4 2g/L; MgSO4H2O 0.058ɡ/L; MnSO4H2O 0.25ɡ/L; pH6.8 。
2.3 菌株的分离和纯化 将分离得到的芽孢杆菌、乳酸菌落分别于平板划线，划线2-3次得到纯的菌 株，并进行菌落形态观察。将菌株转入斜面培养基保存。将分离纯培养物进行接触酶实验和革兰氏染色，挑选接触酶阴性和革兰氏阳性的菌株，并用20甘油保存于-80℃备用。
3.芽孢杆菌的耐受性试验 3.1 芽孢杆菌的人工胃液耐受性试验取芽孢悬液10 mL,加入到90 mL人工胃液中,调整浓度至106 cfu /mL。置于37 ℃生化培养箱中培养3 h,然后进行平板菌落记数,以未经胃液处理的菌悬液作为对照。
3.2 芽孢杆菌的人工肠液耐受性试验取芽孢悬液1 mL,接种于肉汤培养基 中, 37 ℃、120 r/min摇瓶培养24 h。用无菌小肠液作对照,观察培养液的浑浊度。
4．芽孢杆菌、乳酸菌的筛选及其复合代谢物的抑菌活性-初筛 4.1 指示菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、李斯特菌）稀释液的制备 将大肠杆菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌和金黄葡萄球菌四种指示菌接种于LB液体培养基，37℃培养24 h，并进行梯度稀释，做成指示菌稀释液（浓度2.0108CFU／mL）。
4.2 菌悬液制备 4.2.1 芽孢悬液制备制备的芽孢悬液将分离到的菌株活化2次后接种于牛肉蛋 白胨培养基中, 37 ℃、160 r/min下振荡培养36 h,用于芽孢抗逆耐受性及其抑菌试验。
4.2.2 乳酸菌发酵上清液制备将分离得到的乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，16℃静置培养48 h，离心（4℃，10000g，10 min）得到上清液，置于4℃冰箱待用。
4.3 牛津杯法抑菌试验 分别吸取100 L指示菌稀释液（活菌数为2.0108CFU／mL）均匀涂布于LB固体培养基上，再在每个平皿上等间距放置4个牛津杯，向每个牛津杯中加入制备好的菌悬液（芽孢悬液、乳酸菌上清液、芽孢乳酸混合菌液）200 L MRS空白培养基作为对照，于中预扩散5 h，后置于37℃培养，18-24 h后观察实验结果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。挑选出牛津杯周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行下一步试验。
5.益生芽孢杆菌耐药试验滤纸片法 5.1培养基的制作及芽孢杆菌菌悬液的制备 根据需要确定配制营养琼脂培养基用量（如上两种），调节pH，分装在三角瓶中，121℃30min，灭菌时，剪好的滤纸片（直径6mm）放入三角瓶中塞上棉塞一同灭菌。制备芽孢杆菌菌悬液，注意无菌操作，注意浓度选择，用无菌水稀释芽孢杆菌菌悬液至OD600 0.48-0.52，备用。
5.2 涂布法接种 将灭菌后的培养基倒入培养皿中，冷却到50℃以下，用移液枪取0.2ml芽孢杆菌菌液接种在已凝固的培养基上，再用三角形涂布棒将菌液涂布均匀，放置于桌上静置20-30分钟，使菌液渗透到培养基内后再贴滤纸片；
5.3滤纸片的制法及芽孢杆菌的培养 将滤纸浸入已准备好的抗生素（浓度100g/mL，四种杆菌肽、头孢、红霉素、四环素，在实验前需过滤除菌）后，在无菌操作室中进行，用无菌镊子取出并晾干，贴滤纸片时，注意吸附量和位置；
36 -1℃，24h倒置培养后观察培养皿的菌落形态和抑菌圈的大小。
6.乳酸菌的复筛试验 产细菌素乳酸菌的复筛由于乳酸菌在代谢过程中产生的酸、过氧化氢等产物对食源性的致病菌或腐败菌的生长也有一定的抑制作用，为进一步确定菌株MD-1发酵上清液中细菌素组分的存在，对其发酵上清液进行排除酸和过氧化氢的干扰。
6.1 酸及酸性末端产物作用的检测与排除 为检测和排除酸及酸性末端产物的干扰，将初步筛选得到的具有明显抑菌圈的几株乳酸菌接种于MRS培养基中，培养48 h，获取其发酵上清液并进行抑菌实验。用无菌的1 mol/L NaOH调上清液pH值至6.5，不做任何处理的上清液作为对照,分别检测其抑菌活性。
6.2过氧化氢作用的检测与排除 将过氧化氢酶溶解在50 mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）中配成母液，加入到排除酸上清液中使过氧化氢酶的终浓度为5 mg/mL，在37℃水浴中温育2 h 。
7.实验结果及分析 （1）初筛时经多次分离纯化后，得到芽孢杆菌60株，乳酸菌116株。并将其保藏于-80℃，已被后续实验使用。
（2）60株芽孢杆菌经人工胃液耐受性试验和人工肠液耐受性试验后，剩余45株能很好存活，只有具有耐受性的芽孢杆菌才能在猪的肠道中很好存活，从而起到改善肠道菌群的作用。
（3） 经芽孢杆菌耐受试验后筛出45株芽孢杆菌，再经初步的牛津杯法抑菌试验定性筛和琼脂块法抑菌试验两种方法共用（并做好空白对照）来筛选具有抑菌性的芽孢杆菌，经过三次重复试验，共筛出9株芽孢杆菌对三种指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌）均能产生抑菌圈。以下几株菌芽孢杆菌的抑菌活性较明显，见图1-1（a,b,c,d,e,f） a b c d e f 图1-1 通过琼脂块法对芽孢杆菌进行抑菌活性的初步筛选，通过三次重复实验筛得9株芽孢杆菌对指示菌具有不同程度的抑制作用，尤其是菌株F6，对三种指示菌的抑制作用最强。9株芽孢杆菌三次抑菌圈数据及平均值（见表1-1） 表1-1 9株芽孢杆菌三次抑菌圈数据及平均值 （单位mm） 菌种 编号 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 李斯特氏菌 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平 均 BY2 23.10 22.20 22.80 22.70 18.90 19.10 18.20 18.73 17.50 18.20 17.80 17.83 C7 20.80 20.20 19.80 20.30 23.20 22.70 22.90 22.93 18.90 19.50 - 19.20 CX6 19.90 20.30 20.50 20.23 21.80 22.30 21.00 21.70 16.60 17.10 16.80 16.83 C4 21.20 21.70 22.10 21.67 22.50 22.20 22.90 22.53 15.50 16.10 15.80 15.80 DY7 18.90 19.10 - 19.00 23.50 24.00