【九版药理病理学】第十八章,疾病的病理学诊断和研究方法

作者 黄爱民 单位 福建医科大学 第十八章 疾病的病理学诊断和研究方法 第一节大体 组织和细胞病理学技术 第二节组织化学与组织细胞化学技术 第三节电子显微镜技术 第四节显微切割技术 第五节激光扫描共聚焦显微技术 第六节核酸原位杂交技术 第七节原位聚合酶链反应技术 第八节流式细胞术 第九节图像采集和分析技术 第十节比较基因组杂交技术 第十一节生物芯片技术 第十二节第二代测序技术 第十三节生物信息学技术 第十四节人工智能技术 重点难点 病理学诊断和研究基本方法 病理学诊断和研究方法的具体应用范围和意义 病理学研究方法的基本原理 大体 组织和细胞病理学技术 第一节 主要运用肉眼或借助放大镜 量尺和磅秤等工具 观察被检物体的形状 大小 重量 色泽 质地 界限 表面及切面形态 病理学 第9版 一 大体观察 将肉眼确定为病变的组织取材后 以福尔马林溶液固定和石蜡包埋制成组织切片 经不同的方法染色后用光学显微镜观察 病理学 第9版 二 组织病理学观察 采集脱落的细胞 自然分泌物 体液及排泄物中的细胞 以及通过细针穿刺所吸取的细胞 涂片染色后进行观察和诊断 三 细胞病理学观察 病理学 第9版 乳腺细针穿刺细胞学显示乳腺纤维腺瘤细胞学改变 HE染色 400 甲状腺细针穿刺细胞学显示甲状腺乳头状癌细胞 箭头示核沟 HE染色 400 病理学 第9版 病理学 第9版 涎腺细针穿刺细胞学显示黏液样基质及浆细胞 箭头所示 HE染色 400 宫颈液基细胞学显示多量表层细胞 HE染色 400 四 液体活检技术 CTCs检测流程图 病理学 第9版 组织化学和免疫组织化学技术 第二节 一 组织化学 通过应用某些能与组织或细胞的化学成分进行特异性结合的显色试剂 显示病变组织 细胞的特殊化学成分 如蛋白质 酶类 糖类 脂类等 保存组织原有的形态改变 达到形态与代谢的结合 病理学 第9版 肺组织隐球菌PAS染色显示隐球菌荚膜 200 肺组织黏液卡红染色显示隐球菌荚膜呈紫红色染色 200 病理学 第9版 肝糖原PAS染色肝细胞内糖原呈紫红色染色 400 肝组织Masson染色汇管区胶原纤维呈蓝色 400 病理学 第9版 肝组织罗丹宁染色肝细胞内铜颗粒沉积呈橘红色 400 肝组织普鲁士蓝染色肝细胞内含铁血黄素颗粒呈蓝色 400 病理学 第9版 免疫组织化学 IHC 和免疫细胞化学 ICC 是利用抗原 抗体的特异性结合反应以检测和定位组织或细胞中的某种化学物 由免疫学和组织化学相结合而形成 二 免疫组织化学和免疫细胞化学 病理学 第9版 1 IHC染色方法和检测系统2 IHC染色的结果判读 免疫组化染色中常用的标记酶及其底物 HRP 辣根过氧化物酶 DAB 二甲基联苯胺 AEC 3 氨基 9 乙基咔唑 AKP ALP 碱性磷酸酶 BCIP NBT 5 溴 4氯 3吲哚磷酸盐 氯化硝基四氮唑蓝 病理学 第9版 A C B D A 细胞膜阳性 E cadherin B 细胞质内弥漫阳性 HepPar 1 C 细胞核阳性 Ki67 D 细胞膜和细胞质内点状阳性 CD30 2 IHC染色的结果判读 3 IHC染色技术的应用 各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测细胞属性的判定淋巴细胞免疫表型分析激素受体和耐药基因蛋白表达的检测细胞增殖和凋亡的研究细胞周期和信号传导的研究疑难肿瘤的诊断与鉴别诊断 有些组织特异性抗原的检测辅助肿瘤组织来源的判断以及内分泌系统肿瘤的功能分类肿瘤预后评估以及指导临床对靶向治疗药物适用病例的筛选 病理学 第9版 电子显微镜技术 第三节 电子显微镜技术应用领域广泛 胚胎及组织发生学的观察和研究临床上多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性的判断细胞凋亡的形态学观察扫描电镜还可对样本进行三维形貌的细微显示和定量 肿瘤组织微血管形态的电镜观察 肿瘤组织微血管形态的扫描电镜观察 显微切割技术 第四节 显微切割术 microdissection 是从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个 几十个某一特定的同类细胞群甚至单个细胞 再进行后续相关的研究 如PCR PCR SSCP及比较基因组杂交等 冷冻切片的激光显微切割左图 被切割细胞的定位 右图 切割后组织切片上留下的空隙 病理学 第9版 激光扫描共聚焦显微技术 第五节 胶质瘤干细胞的分布和培养 细胞 组织光学切片细胞属性的判定三维立体空间结构重建对活细胞的长时间动态观察细胞内酸碱度及细胞离子的定量测定细胞间通信 细胞骨架构成 生物膜结构等的研究细胞膜流动性测定和光活化技术 LSCM的主要功能 病理学 第9版 核酸原位杂交技术 第六节 一 探针的选择和标记 双链cDNA探针 单链cDNA探针 单链cRNA探针以及合成的寡核苷酸探针探针标记物有放射性和非放射性之分放射性同位素3H 35S 32P非放射性探针标记物有荧光素 地高辛和生物素等 病理学 第9版 可以用直接法或间接法进行FISH 直接法FISH是以荧光素直接标记已知DNA探针 所检测的靶序列为DNA 间接法FISH是以非荧光标记物标记已知DNA探针 再桥连一个荧光标记的抗体 FISH的实验材料可以是间期细胞 分裂中期的染色体 也可以是冷冻或石蜡切片组织 染色体的荧光原位杂交A 一对X染色体 绿色 B Y染色体 红色 C 间期细胞X染色体 绿色 Y染色体 红色 D 一对12号染色体 绿色 二 ISH的主要程序 三 荧光原位杂交 四 ISH技术的应用 细胞特异性mRNA转录的定位 可用于基因图谱 基因表达的研究受感染组织中病毒DNA RNA的检测和定位癌基因 抑癌基因等在转录水平的表达及其变化的检测基因在染色体上的定位染色体数量异常和染色体易位等的检测分裂间期细胞遗传学的研究 原位杂交检测人乳头瘤病毒A 外阴尖锐湿疣的组织形态 B 用生物素标记的针对HPV 6的DNA探针进行原位杂交 在石蜡包埋组织切片上检测HPV DNA 示鳞状上皮棘细胞层中的一些凹空细胞呈细胞核阳性 棕色 DAB显色 病理学 第9版 原位聚合酶链反应技术 第七节 原位聚合酶链反应技术 insituPCR 是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合 在冷冻切片或石蜡包埋组织切片 细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位核酸的技术 病理学 第9版 流式细胞术 第八节 一 流式细胞仪的工作原理 病理学 第9版 二 FCM的应用 分析细胞周期 研究细胞增殖动力学分析细胞的增殖与凋亡分析细胞分化 辅助鉴别良恶性肿瘤快速进行细胞分选和细胞收集细胞多药耐药基因的检测 图像采集和分析技术 第九节 一 病理图像采集 病理学 第9版 扫描控制软件 低倍镜 图像压缩与存储软件 高倍镜 数字切片 传统切片 切片扫描装置 二 病理图像分析 包括定性和定量两个方面图像分析技术主要用于细胞核形态参数 如核直径 周长 面积 体积等 的测定 肿瘤组织病理学分级和预后判断等 也可用于DNA倍体的测定和IHC显色反应的半定量等 病理学 第9版 比较基因组杂交技术 第十节 比较基因组杂交 comparativegenomichybridization CGH 是近年来发展起来的一种分子细胞学技术 它通过单一的一次杂交可对某一肿瘤全基因组的染色体拷贝数量的变化进行检测 比较基因组杂交 CGH A示CGH在共聚焦显微镜下合成的图像 B和C为肺小细胞癌的CGH结果的计算机分析图 B示与各染色体相伴的曲线走向 表示染色体的不均衡性 B原发瘤和转移瘤有大量相同的变化提示其单一克隆关系 红色为DNA丢失 绿色为DNA获得 生物芯片技术 第十一节 基因芯片又称DNA芯片 是指将大量靶基因或寡核苷酸片段有序 高密度地排列在硅片 玻璃片 尼龙膜等载体上 形成DNA微点阵 即基因芯片 一 基因芯片 病理学 第9版 二 蛋白质芯片 一个载体上高密度地点布不同种类的蛋白质 用荧光标记的已知抗体或配体和待测样本中的抗体或配体一起同芯片上的蛋白质竞争结合 利用荧光扫描仪测定芯片上各点阵的荧光强度 经计算机分析计算出待测样本结果 具有高效率 低成本 全自动化检测等特点 尤其适合于蛋白表达的大规模 多种类筛查 还可用于多种感染因素的筛查和肿瘤的诊断 病理学 第9版 组织芯片的特点是体积小 信息含量大 并可根据不同的需求进行组合 可高效 快速地进行各种组织学的原位研究和观察 如形态学 免疫组织化学 原位杂交等 并有较好的内对照及实验条件的可比性 组织芯片A 阵列蜡块 B 经HE染色的组织芯片 其中共有188张组织片 三 组织芯片 病理学 第9版 第二代测序技术 第十二节 第二代DNA测序技术 NGS技术 是将基因组DNA随机打断成一定大小的小片段DNA 给后者加上不同的末端标记 最后通过桥式PCR 原位polony或微乳液PCR获得测序模板NGS技术具有大规模 高通量 短时间 低成本等特点 二代测序技术流程图 3 3 4 6 病理学 第9版 生物信息学技术 第十三节 生物分子信息处理流程 病理学 第9版 人工智能技术 第十四节 病理学 第9版 人工智能技术 疾病的病理学诊断包括活检 细胞学检查和尸检 随着生物医学新技术的快速发展与广泛应用 除传统病理学技术外 许多新的先进技术手段已经应用在疾病的研究 病理学诊断和病理学教学中