第八章位点特异性重组与的转座ppt课件

第八章位点特异性重组与DNA的转座 1 保守性位点特异性重组2 位点特异性重组的生物学作用3 转座4 转座子及其调控 本章内容 重组的两种形式 一 保守性位点特异性重组 CSSR 1 位点特异性重组发生在目标DNA上的特异序列中 噬菌体基因组嵌入宿主染色体中 3种CSSR重组方式 参与保守性位点特异性重组的结构 位点特异性重组的分子机制 attP和attB交错切割发生重组 噬菌体的attP为P O P 细菌的attB为B O B O为attP和attB相同的核心序列 长15bp 重组发生在此序列中 attP235bpattB23bpP O P B O B 1520 82 110 11 GCTTTTTTATACTAA CGAAAAAATATGATT 2 位点特异性重组酶利用共价蛋白 DNA中间体切割分离与连接DNA 位点特异性重组酶有两个家族 丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶 丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白 DNA中间体 重组酶的家族与功能 丝氨酸重组酶催化的重组 二 位点特异性重组的生物学作用 细胞与病毒用位点特异性重组可实现各种各样的生物学功能 噬菌体利用重组机制在感染时将本身DNA嵌入到宿主染色体中 位点特异性重组可用于改变基因表达 位点特异性重组还广泛用于DNA复制 同源重组和细胞分裂周期中保持环状DNA分子的结构完整 1 嵌合酶可促进病毒基因组与宿主细胞染色体的嵌合和分离 2 噬菌体 的分离需要一种新的DNA弯曲蛋白 重组位点 IHF弯曲DNA进入DNA结合位点模型 3 Hin重组酶反转DNA片段使其他基因表达 沙门氏菌感染人类细胞的电镜图 沙门氏菌重组催化DNA反转 4 Hin重组需要一个DNA增强子 5 重组酶将环状多聚DNA分子转化为单体 6 其他机制 转座因子的发现 B McClintock的玉米遗传研究1951年 B McClintock根据长期对玉米的遗传研究 提出了转座 transposition 的概念 提出基因可以移动的新观点 Shapiro的E coli半乳糖操纵子研究 半乳糖操纵子 galK基因编码半乳糖激酶 galT基因编码半乳糖尿苷酰转移酶 galE基因编码半乳糖异构酶 三 转座 半乳糖操纵子 1 一些遗传元件通过转座 transposition 转到新的染色体位置上 2 有3种类型的转座因子 DNA转座子 类病毒反转座子 poly A反转座子 基因组中的转座子 出现位置与分布 原核生物转座因子 类型 1 插入序列 insertionsequence IS E coliK12中有IS1 IS2 IS3 IS4 IS5 E coli的F因子中有IS2 IS3 4个 末端的序列相同或相近 但方向相反 称为反向重复序列 IR 与其相连的宿主DNA末端会产生正向重复序列 DR 仅编码与转座有关的转座酶 转座酶交错切割宿主DNA 然后IS插入 IS两端形成DR IS的结构与功能 部分IS的结构 靶重复的形成 2 复合转座子 compositetransposon 两端由IS元件组成 元件相同或不相同 方向相同或不相同 两端元件都有功能或仅一侧元件有功能 中心区域编码抗性标记 不同复合转座子的抗性标记不同 例如Kanr Camr Strr Bler等 两个IS元件能够使它们之间的DNA序列转座 复合转座子的结构 真核生物转座因子 玉米的转座因子 1 McClintock的发现玉米的红色花青素合成受多基因控制 使胚乳呈紫色 其中任一基因突变都使色素合成受阻 胚乳变白 如果发生回复突变 会导致斑点产生 McClintock发现 色素基因C突变是由 可移动的控制因子 引起的 称为解离因子 dissociator Ds 它可插入C基因中 另一可移动的控制因子是激活因子 activator Ac Ac能激活Ds转入C基因 也能使Ds从C中转出 这就是Ac Ds系统 玉米色斑的形成 2 玉米的控制因子家族McClintock还发现了Spm Dspm系统 每个家族都有自主性因子和非自主性因子 自主性因子有切离和转座能力 可插入任何位点产生不稳定的或可 突变 mutable 等位基因 自主性因子的丢失 可使可变的等位基因变成稳定的等位基因 非自主性因子是稳定的 自身不能转座 来源于失去反式作用功能的自主因子 而这种功能是转座所必须的 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定的 一个家族由单个类型的自主因子组成 这些因子由很多种非自主因子相伴随 玉米Ac Ds系统的结构 Ac序列由含5个内含子的单个基因编码 其产物为转座酶 末端有11bp的IR和8bp的DR Ds是由Ac缺失产生的 Ds9缺失194bp Ds6只保留2Kb 转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点 包括末端 Ac Ds属于非复制型转座 发生转座后 它们从供体位置上消失 果蝇的P因子 1 果蝇的 杂种不育 品系某些果蝇品系杂种后代现一系列缺陷 在P M系统的杂交中 子一代具有正常的体细胞组织 但性腺不能发育 P P F1正常能育M M F1正常能育M P F1正常能育P M F1不育 2 P因子 研究发现 杂种不育是由于在W位点插入P因子 Pelement 所致 P品系有P因子 M品系无P因子 P因子长2 9Kb 有4个开放阅读框 ORF 末端有31bp反向重复序列 靶DNA产生8bp的正向重复序列 一个P品系果蝇带有30 50拷贝的P因子 其中1 3具完整结构 不完整的P因子是由于缺失而产生的 丧失转座能力 P因子的激活有组织特异性 它仅发生在生殖细胞中 但P因子在体细胞和生殖细胞中都转录 组织特异性表现在不同的细胞中转录的方式不同 剪接方式不同 3 P因子的组织特异性表达 P因子有3个内含子 4个开放阅读框 ORF0 ORF3 初始转录本有2 5Kb和3 0Kb两种长度的RNA 不同组织中产生不同的蛋白质 在体细胞中 剪切内含子1和内含子2 保留内含子3 产生ORF0 ORF1 ORF2编码区 翻译成66KDa蛋白 是一种转座的阻遏物 在生殖细胞中 剪去3个内含子 产生4个阅读框的编码区 翻译成87Kda蛋白 是一种转座酶 P基因的结构及其表达产物 4 P M 杂种不育的解释 杂种不育主要原因是内含子3的组织特异性剪接 P P 66KDa蛋白阻止P元件转座M P 66KDa蛋白阻止P元件转座P M 父本P产生87Kda蛋白 转座酶 导致后代不育 果蝇不同杂交组合P产物对育性的影响 3 转座的类型 复制型转座 转座元件被复制 转座的序列是原元件的拷贝 转座子复制后一个拷贝保留在原位 一个拷贝转移到另一位置 非复制型转座 转座元件从一个位置转移到另一位置 保守型转座 另一类非复制型转座 转座因子从供体位点上切离 插入靶位点上 供体上转座子两侧的DNA双链被保留 复制型转座的基本过程复制型转座要产生一个共合体 其原理是 游离的3 端以已连接的转座子为模板进行复制 连接 使转座子产生重复 形成共合体 共合体的形成 Mu噬菌体转座产生共合体 非复制型转座的基本原理转座子插入靶DNA 两侧为靶DNA正向重复序列 供体部位留下缺口 模式1转座因子和受体分子形成形成交叉结构 受体分子的单链切口与转座因子单链游离末端连接 并在插入位点上产生正向重付序列 通过交换使转座因子转座到受体分子 模式2供体分子上转座因子两端产生双链断裂 使转座因子释放出来 然后在受体分子产生的交错接口处插曲 非复制型转座模式1 非复制型转座模式2 4 反转录病毒和反转座子转座子是基因组中独立的可移动的DNA序列 从DNA到DNA的转移称为转座 从DNA到RNA再到DNA的转移称为反转座 反转座是由RNA介导的转座过程 以RNA为中间体的转座为真核生物所特有 反转录病毒能将其RNA基因组的DNA拷贝以原病毒的形式整合到宿主基因组中 一些真核生物转座子的结构与原病毒的结构有关 并且通过RNA中间体进行转座 这一结构单位称为反转录转座子 retrotransposons 或反转录子 retroposons 1 反转录病毒及其生活周期 反转录病毒具有单链RNA基因组每个病毒颗粒包装有两个RNA基因组 因此 单一病毒颗粒实际上是二倍体 反转录病毒生活周期反转录病毒 正链病毒 感染细菌 病毒RNA反转录DNA 负链DNA 催化合成第二条DNA链 正链DNA 整合到宿主DNA中成为原病毒 转录生成病毒基因组RNA 转录出病毒mRNA 翻译成病毒蛋白质或者作为子代病毒基因组 反转录病毒生活周期 2 反转录病毒基因组结构与功能 含有3 4个基因 实为编码区 每各编码区通过加工产生多种蛋白 多聚蛋白 经酶切成为单一的蛋白质形式 反转录病毒mRNA通常结构 5 端加帽 3 端与polyA相连 全长的mRNA被翻译时 产物为gag和pol蛋白 翻译从第一个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子 产物为gag蛋白 表达pol蛋白必需越过终止密码子 效率为5 因此 gag蛋白是gag pol蛋白的20倍 经剪切产生一个短的亚基因组 subgenomic 的mRNA 其表达产物为env 反转录病毒 基因 的表达 3 反转录病毒的结构形式 病毒基因组RNA结构两个末端有正向重复序列R 10 80bp 5 端R之后是U5 80 100bp 3 端R内侧是U3 170 1260bp 病毒线形双链DNA结构5 端加U3 3 端加U5 U5 R U3称为长末端重复 LTR 原病毒RNA结构 类似转座子 U3和U5末端丢失2bp 靶DNA两侧产生4 6bp重复序列 LTR的结构 4 病毒线性DNA整合到宿主基因组 整合过程由整合酶催化 在3 端切除CA两个碱基 成为粘性末端 靶位点随机选择 交错切割5 端4 6个碱基 整合酶将LTR3 端与靶DNA5 端连接 一个连续感染的细胞可获得1 10个原病毒 每个LTR的U3有一个启动子 左侧LTR中的启动子发起与整合位点相连接的宿主序列的转录 这个LTR带有一个增强子 可以作用于细胞和病毒的序列 一个反转录病毒的整合可能使某些基因激活 使宿主细胞转变为肿瘤细胞 5 病毒类反转座子反转录病毒是反转座子的范例 其转座能力是由于能编码反转录酶和整合酶 反转座子和反转录病毒的区别在于其不经特异的感染形式 但转座机制相似 反转座子分为两类 病毒类反转座子和非病毒类反转座子 6 非病毒类反转座子 非病毒类反转座子的内部和外部结构它们来源于RNA序列 是细胞内发生了突变基因的产物 可以假定它们是负责转座的酶系统的底物 但它们不编码有转座功能的蛋白质 哺乳动物基因组中 有一类核苷酸序列高度相似的重复序列 主要是基因以外的DNA序列 可分为串联重复序列和散在重复序列 它们多来源于RNA介导的转座过程 来源于反转录转座子 散在重复序列是中度重复序列 根据重复序列的长度分为两类 短散在重复序列 SINEs 和长散在重复序列 LINEs 短散在重复序列 SINEs 长度在500bp以下 人基因组中有10万以上拷贝 长散在重复序列 LINEs 长度在1000bp以上 人基因组中有上万拷贝 Alu是SINE家族的典型代表 人基因组中有50万 100万个拷贝 平均每隔4Kb就有一个Alu序列 典型的Alu序列长282bp有内切酶Alu的识别序列ACCT 在非洲录猴 小鼠 中国仓鼠中也发现Alu序列 Alu序列由两个同源的但序列有差异的亚基组成 亚基来源于发生了缺失突变和点突变的7SLRNA基因 7SL是信号识别颗粒的组成部分 7SLRNA5 端的90bp与Alu序列左半边序列同源 7SLRNA3 端的40bp与Alu序列右侧末端同源 7SLRNA中间的160bp与Alu序列没有同源性 Alu序列同反转座子结构一样 两边各有一个正向重复序列 右边的亜基中有一个31bp的插入序列 Alu序列末端有一个多聚线苷尾 各个Alu成员两端的正向重复序列各有不同 以下两个是人Alu成员的核苷酸序列 GTTTAGATAAG Alu A25GTTTAGATAAAAAAGAAATG Alu A14GA3GA4GA5GA6GA