2、（a）基因工程的原理及技术 原理基因重组 技术（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”DNA连接酶 1两种DNA连接酶（EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较 ①相同点都缝合磷酸二酯键。
②区别EcoliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；
而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
2与DNA聚合酶作用的异同 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”载体 （1）载体具备的条件①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是 质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体 噬菌体的衍生物、动植物病毒 二基因工程的基本操作程序 第一步目的基因的获取 1.目的基因是指 编码蛋白质的结构基因 。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理DNA双链复制 （2）过程第一步加热至90～95℃DNA解链；
第二步冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步基因表达载体的构建 1.目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行 抗原－抗体杂交。
4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
（三）（b）基因工程的应用 1.植物基因工程抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2.动物基因工程提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
3.基因治疗把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
（四）（a）蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）（1）蛋白质工程崛起的缘由基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质 （2）蛋白质工程的基本原理它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
基本途径从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；
以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意目的基因只能用人工合成的方法） 设计中的困难如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列 二、细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）细胞全能性 2.植物组织培养技术（b） （1）过程离体的植物器官、组织或细胞 →愈伤组织 →试管苗 →植物体 （2）用途微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
A 植物繁殖 微型繁殖可以高效快速地实现种苗的大量繁殖 作物脱毒采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有） 人工种子以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；
方便储藏和运输 B 作物新品种培育 单倍体育种 a过程植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；
对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；
得到单倍体植株；
对其幼苗时期进行秋水仙素处理；
得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。
b 优点明显缩短育种年限 C 突变体利用在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体） D 细胞产物的生产通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。
（3）地位是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
② 植物细胞A 植物细胞B 杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 ① ③ ④ ⑤ 图（2） 3.植物体细胞杂交技术 （1）过程 （2）诱导融合的方法物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养（a） （1）概念动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①无菌、无毒的环境培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养合成培养基成分糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度适宜温度哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；
pH7.2～7.4。
④气体环境95空气＋5CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。
（2）选用去核卵母细胞的原因卵母细胞比较大，容易操作；
卵母细胞细胞质多，营养丰富。
（3）体细胞核移植的大致过程是 高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；
同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）[注为什么要用卵细胞它可以提供充足的营养；
操作简便；
细胞质不会抑制细胞核全能性的表达]；
将供体细胞注入去核卵母细胞；
通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；
将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；
生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛 （4）体细胞核移植技术的应用 ①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；
②保护濒危物种，增大存活数量；
③生产珍贵的医用蛋白；
④作为异种移植的供体；
⑤用于组织器官的移植等。
（5）体细胞核移植技术存在的问题 克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
3.动物细胞融合 （1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（3）动物细胞融合的意义克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较 细胞工程 植物体细胞杂交 动物细胞融合 理论基础 细胞的全能性、细胞膜的流动性 细胞增殖、细胞膜的流动性 融合前处理 酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶） 注射特定抗原，免疫处理正常小鼠 诱导手段 物理法离心、振动、电激 化学法聚乙二醇（PEG） 物理法离心、振动、电激 化学法聚乙二醇 生物法灭活的病毒（灭活的仙台病毒） 诱导过程 第一步原生质体的制备 （酶解法） 第二步原生质体融合（物、化法） 第三步杂种细胞的筛选和培养 第四步杂种植株的诱导与鉴定 正常小鼠免疫处理 动物细胞的融合（物、化、生法） 杂交瘤细胞的筛选与培养 专一抗体检验阳性细胞培养 单克隆抗体的提纯 用途和意义 克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围 应用白菜-甘蓝等杂种植株 （1） 制备单克隆抗体 （2） 诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症 4.单克隆抗体 （1）抗体一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
（2）单克隆抗体的制备过程 对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；
提取B淋巴细胞；
同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；
促使它们细胞融合[注融合的结果是有很多不符合要求的；
如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选]；
在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞[特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体]；
然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞]；
最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。
（3）杂交瘤细胞的特点