oHSV1GFP法检测肝癌循环肿瘤细胞_阴丽媛精编版

第 卷第 期 年 月 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 法检测肝癌循环肿瘤细胞 阴丽媛 张 文 肖 汀 荣维淇 王 云 韩迺君 邸雪冰 郭素萍 刘滨磊 张开泰 程书钧 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院病因及癌变研究室 中国医学科学院肿瘤 医院免疫学研究室 中国医学科学院肿瘤医院腹部外科 北京 收稿日期 修回日期 基金项目 国家科技支撑计划资助 国家自然科学基金资助 作者简介 阴丽媛 女 年 汉族 硕士研究生 通讯作者 摘要 目的 循环肿瘤细胞在肿瘤转移诊断 个体化治疗 疗效评估及肿瘤转移机制研究等方面具有重要价值 然而 由于其在循环系统中比例极低 循环肿瘤细胞的分离和鉴定成为临床应用的难点 是一种经过基因修饰的人单 纯疱疹病毒 我们将该病毒的复制关键基因 的启动子替换为人端粒酶逆转录酶的启动子 并在 下游连接 表 达盒 以使该病毒在感染细胞后 能在端粒酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋白的表达基因 本研究旨在利 用该病毒捕获循环肿瘤细胞 从而建立一种简便重复性好灵敏度高的检测方法 并对该检测方法的可靠性及临床应用价值进 行探讨 方法 技术检测肿瘤细胞系 肿瘤组织及正常细胞中端粒酶逆转录酶表达情况 抽取正常健康人外周 血 将肿瘤细胞系分别按一定梯度加到外周血中 按照 比例转染重组病毒 流式细胞仪检测 细胞数 进行该方法检出率的测定 收集临床标本外周血 裂解去除红细胞后 按照 比例转染重组 病毒 后收集细胞 流式细胞仪检测 细胞并计数 初步检测该方法临床应用的可行性 结果 检测结果显示肿瘤细胞系及肿瘤组织呈现端粒酶逆转录酶高表达状态 而正常细胞中端粒酶逆转录酶表 达量低 在该检测方法中 我们将 细胞定义为循环肿瘤细胞 检出率测定结果显示 外周血中加入 细胞 个 的检出数分别为 总体检出率为 外周血中加入 细胞 个 的检出数分别为 总体检出率为 线性回归分析显示该方法捕获 的细胞数与实际肿瘤细胞数呈明显相关性 应用该方法检测 例肝癌患者及 例正常健康人外周血显示 肝癌 患者外周血中 的细胞数 明显高于正常健康人 亚组分析显示区域淋巴结 阳性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数 明显高于区域淋巴结 的患者 结论 本研 究建立了一种新型循环肿瘤细胞检测方法 并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估 该方法能够特异性示踪循环 肿瘤细胞 具有潜在临床应用价值 关键词 循环肿瘤细胞 单纯疱疹病毒 转移 人端粒酶逆转录酶 中图分类号 文献标识码 第 期 阴丽媛等 法检测肝癌循环肿瘤细胞 恶性肿瘤的复发和转移是肿瘤患者死亡的主要 原因 利用现代免疫学和分子生物学技术能够在 肿瘤患者血液中检测到一种微转移细胞 称为循环 肿瘤细胞 为 实体瘤或转移灶中的肿瘤细胞脱落进入到外周血液 循环的具有转移倾向的肿瘤细胞 临床研究发 现 在结直肠癌 乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤中 计数可作为预后评估的独立预测指标 并对早 期评估抗肿瘤疗 效具有潜在价值 目 前 富集 的方法主要有两大类 免疫磁性分离法和基于 形态学富集法 采用上皮细胞粘附分子 角蛋白 等细胞表面分子标志物的抗体标记后 再检测是目前应用最广泛的方法 如 系 统 系统是一项半自动检测系统 能够 自动捕获实体瘤中脱落到循环血中的肿瘤细胞 对 转移癌的诊断有较高的特异性 但由于 局 限于上皮来源肿瘤细胞 因此限制了 系统的 检测能力 另一方面肿瘤细胞在转移 过程中可能会发生上皮间质转化 和 表达下调 导致捕获率下降 基于形态学富集法利 用 比外周血细胞体积大和硬度高的特点 通 过过滤富集后结合免疫细胞化学的方法进行检测 但是 的大小和变形性具有异质性 此类方法难 有统一的检测流程和质控标准 研究表明 的恶性肿瘤不同程度表达端粒 酶 正常情况下人类体细胞端粒酶的检测结果 为阴性 人类端粒酶主要由 成分 端 粒 酶 相 关 蛋 白 和 催 化 亚 单 位 三部分组成 的 表达并 不限于有端粒酶活性的组织和细胞系 各组织的水 平差异与端粒酶活性无关 因此 端粒酶活性并不是 由 决定 则是端粒酶活性所必需的 核心组分 可识别单链富含 的寡核苷酸 引物 以其 组分的碱基为模板与端粒重复序 列进行碱基互补配对 在合成 延伸碱基序列中起催 化作用 利用 启动子进行转录基因调 控是目前抗肿瘤靶向研究中热点之一 是一种经过基因修饰的人单纯疱疹病毒 我 们将该病毒的复制关键基因 的启动子替换为 人端粒酶逆转录酶的启动子 并在 下游连接 表达盒 以使该病毒在感染细胞后 能在端粒 酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋 白基因的表达 研究利用构建的病毒 特异性示踪循环血液中肿瘤细胞 通过荧光显微镜 或流式细胞仪直接检测荧光信号对 进行计数 材料和方法 病毒 的构建 研究 利 用 基 因 修 饰 方 法 将 的 基 因 敲除 替换为 表达盒 病毒 由中国医学科学院免疫学教研室提供 该 病毒在感染细胞后 能在端粒酶逆转录酶转录环境 的作用下激活下游绿色荧光蛋白基因的表达 细胞培养 人非小细胞肺癌细胞系 美国 人肝癌细胞系 美国 人结直肠癌 细胞系 美国 人胶质瘤 细胞系 级 美国 在含有 胎牛血清的 美国 完 全培养基中置于 条件下培养 人胚肺 成纤维细胞 美国 在含有 非必需 氨基酸 胎牛血清 美国 完 中国组织化学与细胞化学杂志第 卷 全培养基中置于 条件下培养 细胞总蛋白提取和 分析 用含有 苯甲基磺酰氟 蛋白酶 抑制剂的 蛋白裂解液 普利莱 中国 提取细 胞总蛋白 采用 美国 进行蛋白定量后用于 分析 所 用抗体为 药明康德 中国 临床标本收集 收集对象为中国医学科学院肿瘤医院腹部外科 年连续收治的原发性肝细胞肝癌患者 例健康体检的正常人作为对照 随机选取 例肝癌患者 期 外周血 为血标本 随机选取 例肝癌患者 期 手术 切除的肿瘤组织为组织标本 标本处理 用 抗凝采血管采集患者 外周 血 红细胞裂解液 室 温裂解 离心弃上清 洗涤细胞后用无血 清培养基重悬细胞 按照 比例感染细胞 孵育 后收集细胞 用 标记的抗人 抗体室温避光 孵育 洗涤细胞一次 之后用 重悬细胞 流式细胞仪检测 的细胞 为循环肿瘤细胞 统计学分析 该方法的检出率分析使用软件 中线 性回归模型分析 结 果 端粒酶逆转录酶在不同肿瘤细胞系 正常细 胞及肿瘤组织中的表达情况 检 测 在 肝 癌 细 胞 系 结 直 肠 癌 细 胞 系 胶 质 瘤 细 胞 系 肺 腺 癌 细 胞 系 及正常细胞系 中端粒酶的内源性表达 量 结果显示正常细胞系 中 表达量 很低 图 肿瘤细胞系中端粒酶均有表达 表达 量明显高于正常细胞组 此外 检测手 术切除的肿瘤组织中的端粒酶逆转录酶表达量 结 果显示在 例肝癌患者手术切除的肿瘤组织标本中 表达量有差异 但均可检测到 的表 达 图 图 在细胞系及肿瘤组织中的表达情况 检测 在 细胞系中表达量 图中 依次代表 细胞系 检测 在 例肝癌患者手术切除的肿瘤组织表达情况 图中 依次代表不同病例编号 不同肿瘤细胞系感染 病毒后 表达情况 应用 病毒按照 感染肿瘤 细胞系 分别在感染后 应用倒置荧光显微镜观察 结果显示 该两株肿瘤 细胞系在感染病毒后 稳定表达绿色荧光蛋白 第 期 阴丽媛等 法检测肝癌循环肿瘤细胞 图 感染病毒后荧光照相显示 表达情况 肺癌细胞系 按照 感染病毒 后 荧光图 肝癌细胞系 按照 感染病毒 后荧光图 结果显示肿瘤细胞系在感染病毒 后均可以稳 定表达绿色荧光蛋白 方法检出率测定 抽取 名正常志愿者外周血各 将肿瘤细 胞系 分别按 个 加 到外周 血 中 模 拟 循 环 肿 瘤 细 胞 应 用 方法检测外周血中 细胞 结果 显示外周血中加入 细胞 个 的检出数分别为 线性回归模型分析得到总体检出率为 外周血中加入 细胞 个的检出数分 别为 线性回 归模型分析得到总体检出率为 回归分析 显示 细胞与循环肿瘤细胞模型中的 肿瘤细胞数具有明显相关性 模型 模型 图 图 肿瘤细胞系模拟循环肿瘤细胞检出率 外周血中加入 细胞 个的检出数分别为 外周血中加入 细胞 个的检出数分别为 线性模型回归分析显示 细胞与循环肿瘤细胞模型中的肿瘤细胞数呈线性关系 总体检出率分别为 应用 方法检测肿瘤患者外周 血标本中肿瘤细胞 临床收取 例原发性肝细胞肝癌患者 期 外周血 将 例样本按照区域淋巴结病理诊断 阳性及阴性各分为两组 以及 例正常人外周血各 用 方法进行标记后 流式细胞仪 中国组织化学与细胞化学杂志第 卷 检测循环血液中 细胞 并计数 图 例肝癌患者外周血中 的细胞 数 个 明显 高 于 正常健 康人 个 其中区域淋巴 结阳性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数 明显高于区域淋巴结 的患者 图 临床样本循环肿瘤细胞计数 收集 例正常人 外周血及 例肝癌患者外周血 用 检测循 环肿瘤细胞 肝癌患者外周血中 的细胞数为 个 正常健康人外周血中 的细胞数为 个 区域淋巴结阳 性的患者外周血中循环肿瘤细胞计数 明显高 于区域淋巴结阴性 的患者 讨 论 检测具有无创 简便 重复性好及临床应 用潜力大等优点 越来越引起研究者的关注 然而 在外周血中的含量极少 每 血液中可 能仅含少数几个 准确检测到 非常困 难 目前的检测手段主要是基于肿瘤细胞表面 的分子标志物如 及白细胞表面分子标 志物 通过免疫磁珠进行富集 富集后的细胞 在显微镜下观察计数 然而播散的肿瘤细胞往 往存在角蛋白 表达缺失 细胞及细胞间粘附分子表达下调以及上皮间质转化 等 从而导致 表达下调 鉴于此 此类 方法检测 存在一定的局限性 研究新建立了一种新的溶瘤病毒特异性示踪肿 瘤细胞的检测方法 结果显示该方法可以较为准确 检测到 端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关 细胞端粒酶活性因某些原因被激活 使端粒维持在 一定长度 细胞因此成为无限增殖细胞 研究显示 以上的肿瘤中可以检测到端粒酶 该方法 基于端粒酶的活性 示踪肿瘤细胞敏感性好 瘤谱 广 有望成为一种有效的监测循环肿瘤细胞的方法 另一方面 该方法能够示踪具有生物活性的肿瘤细 胞 这样大大减少了循环血中已凋亡 的肿瘤细 胞的假阳性干扰 可以给临床提供更加准确的信息 此外 我们用该方法可以将标记的肿瘤细胞分选获 得单个细胞 为后续测序或药敏实验研究以及更为 深层的癌症转移的机制信息的获取提供了可能 总 结本研究工作 我们开发了一种新颖便捷的 检 测及捕获技术 其对癌细胞的检测的准确性已经得 到实验证明 该技术检测方法简单 重复性好 价格 便宜 在今后大规模临床应用具有极大的优势 当 然 目前还只是初步研究 仍然需要今后的工作进一 步完善研究如优化分选条件 从循环系统中捕获肿 瘤细胞 应用基因组测序或表达谱芯片技术深入研 究肿瘤发生转移的分子机制 参 考 文 献 第 期 阴丽媛等 法检测肝癌循环肿瘤细胞 施桂兰 庄秀芬 韩香萍 表达绿色荧光蛋白的单纯疱 疹病毒检 测循 环肿瘤 细 胞 中 华 肿 瘤 杂 志